外周血EETs水平与咳嗽变异性哮喘患儿Th1和Th2及其细胞因子、小气道功能的相关性分析

蒋萍影,唐国英

(重庆市开州区人民医院儿科,重庆 405400)

小儿咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma,CVA)是一种特殊类型的哮喘,以咳嗽为唯一或主要临床表现,对支气管扩张剂治疗有反应,具有气道高反应、嗜酸性粒细胞炎症和气道重塑等经典哮喘特征,CVA患儿往往反复咳嗽发作,部分患儿最终进展为典型哮喘[1]。嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS)参与感染诱导的免疫应答,参与免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介导的Ⅰ型超敏反应过程,EOS气道炎症可增加CVA小气道功能障碍[2]。嗜酸性粒细胞胞外诱捕网(eosinophil extracellular traps,EETs)是EOS以弹射器形式释放的线粒体、细胞核内DNA、组蛋白及游离颗粒组成的网状结构,具有免疫调节和促炎作用,可促进气道高分泌和炎症反应,在哮喘、变应性支气管肺曲霉病、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病中发挥重要作用[3]。EETs与CVA相关性的报道十分少见,其临床意义尚不清楚。本研究拟探讨EETs与CVA的免疫功能、炎症因子及小气道功能的关系,以期为临床CVA的诊治提供参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年10月至2022年10月重庆市开州区人民医院收治的95例CVA患儿为CVA组,其中男51例(53.68%),女44例(46.32%);年龄为5～12岁,平均(9.12±2.09)岁。

纳入标准:①符合《咳嗽的诊断与治疗指南(2015)》[4];②近期无呼吸道感染史及激素、免疫抑制剂应用史;③年龄在5岁以上,能配合小气道功能检测;④患儿家属或监护人均知情同意,并签署同意书。排除标准:①合并支气管炎、支气管扩张、肺癌、囊性纤维化或肺炎等其它肺部疾病;②合并上气道咳嗽综合征、嗜酸性支气管炎和胃食管反流相关咳嗽;③合并心、肝、肾等重要器官功能障碍;④合并恶性肿瘤。

另选取同期于本院儿科保健门诊体检的67例健康儿童为对照组,均排除近2周内感染、免疫缺陷及系统性疾病,其中男39例(58.21%),女28例(41.79%);年龄为5～12岁,平均(9.37±2.21)岁。

CVA组与对照组的性别、年龄比较差异均无统计学意义(χ2=0.732、t=0.326,P>0.05)。

本研究已经获得重庆市开州区人民医院医学伦理委员会批准(编号:2019Z210)。

1.2 方法

1.2.1 CVA的诊断标准

①刺激性干咳,清晨或夜间发作;②支气管激发试验(bronchial provocation test,BPT)阳性或最大呼气峰流速(peak expiratory flow,PEF)平均变异率>10%或支气管舒张试验阳性;③抗哮喘治疗有效[4]。

1.2.2 EETs的检测

所有CVA患儿入组后(对照组于门诊当日),均于次日晨采集外周静脉血5mL,注入含柠檬酸-葡萄糖溶液的Vacutainer®真空采血管(美国BD公司)中,以密度梯度离心法(挪威Axis-Shield公司生产的LymphoprepTM密度梯度离心液,20℃,879×g离心25min)分离外周血单个核细胞,再采用EOS分离试剂盒和免疫磁珠细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)(美国Miltenyi Biotec公司),从中分离EOS。取外周血EOS(1×106)样本,将EOS维持在无血清RPMI-1640培养基(美国Thermo Fisher Scientific)中,用1mg地塞米松(美国Sigma-Aldrich公司)、10mg羟氯喹(美国Sigma-Aldrich公司)或1μg/mL的n-乙酰-l-半胱氨酸(美国Sigma-Aldrich公司)预处理15min。采用25ng/mL的人重组白细胞介素(interleukin,IL)-5(美国Sigma-Aldrich公司)引发20min,并用0.3μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美国Sigma-Aldrich公司)刺激3h,以诱导EET。使用Quant-iTTMPicoGreen®dsDNA试剂盒(美国Invitrogen公司)测量DNA浓度,以QuantiPro BCA Assay Ki(美国Sigma-Aldrich公司)评估蛋白质浓度,以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚和抗促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)抗体(美国Cell Signaling公司)对细胞进行染色,用Zeiss LSM710共聚焦显微镜(德国Carl Zeiss AG公司)观察形成EETs的EOS,计算形成EETs的EOS百分比,并以%表示。

1.2.3辅助性T淋巴细胞1和辅助性T淋巴细胞2的检测

所有CVA患儿入组后(对照组于门诊当日),均于次日晨采集外周静脉血2mL,以Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)洗涤2次,将细胞悬浮在RPMI 1640培养基(美国Sigma-Aldrich)中,37℃孵育4h,加入50μL乙二胺四乙酸涡旋,室温下孵育15min,加入5mL FACS Permeabilizing Solution(美国BD Biosciences),去离子水以1∶10比例稀释,涡旋并孵育10min,250×g离心10min,加入7mL Cell Wash洗涤弃上清,再次洗涤弃上清,平均注入2个流式管中,分别加入20μL干扰素(interferon,IFN)-γ PE(美国Biolegend)、5μL IL-10 PE-Cy7(美国Biolegend),4℃避光孵育30min,PermWash缓冲液重复洗涤2次,加入450μL的PBS重悬细胞,用Attune NxT流式细胞仪(美国赛默飞公司)检测辅助性T淋巴细胞(Th)1和Th2细胞百分比,计算Th1/Th2比值。

1.2.4 Th1和Th2细胞因子的检测

所有CVA患儿入组后(对照组于门诊当日),均于次日晨采集外周静脉血2mL,注入干燥试管,待血液自然凝固后取上层液离心(37℃,650×g离心5min)分离血清,采用WX-SY96A酶标仪(山东万象环境科技有限公司),应用酶联免疫吸附试验检测Th1(血清IL-2、IFN-γ)和Th2(血清IL-4、IL-6)细胞因子水平,试剂盒购自上海酶联生物公司。

1.2.5小气道功能的评估

所有CVA患儿入组后(对照组于门诊当日),采用FGY-200便携式肺功能检测仪(济南泰医生物技术有限公司)测定小气道功能,检测过程中指导患儿用力吸气后尽力呼出最大量气体,记录25%、50%、75%肺活量的最大呼气量(FEF25%、FEF50%、FEF75%),以及最大中期呼气流速(FEF25%～FEF75%),测量3次,取平均值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组外周血形成EETs的EOS百分比水平比较

CVA组外周血形成EETs的EOS百分比为(20.35±6.09)%,对照组为(6.32±1.28)%,CVA组外周血形成EETs的EOS百分比明显高于对照组,经比较差异有统计学意义(t=18.554,P<0.05)。

2.2 两组Th1和Th2细胞占比及比值比较

CVA组Th2细胞占比明显高于对照组(P<0.05),Th1细胞占比、Th1/Th2比值均明显低于对照组,经比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组Th1、Th2细胞占比及Th1/Th2比值的比较

2.3 两组Th1和Th2细胞因子水平比较

CVA组血清IL-4、IL-6水平均明显高于对照组,血清IL-2、IFN-γ水平均明显低于对照组,经比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组Th1和Th2细胞因子水平的比较

2.4 两组小气道功能比较

CVA组FEF25%、FEF50%、FEF75%,以及FEF25%～FEF75%均明显低于对照组,经比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 两组小气道功能各指标的比较

2.5 外周血形成EETs的EOS百分比与Th1和Th2及其细胞因子和小气道功能的相关性分析

CVA组外周血形成EETs的EOS百分比与Th2细胞占比及血清IL-4水平和血清IL-6水平均呈正相关(r值分别为0.532、0.421、0.395,P<0.05),与Th1细胞占比、Th1/Th2比值、血清IL-2水平、血清IFN-γ水平、FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～FEF75%均呈负相关(r值分别为-0.253、-0.605、-0.321、-0.385、-0.421、-0.377、 -0.485、 -0.568,P<0.05)。

2.6 外周血形成EETs的EOS百分比诊断CVA的价值分析

经ROC分析结果显示,外周血形成EETs的EOS百分比诊断CVA的临界值为15.42%,曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.760(95%CI:0.687～0.824),灵敏度为78.95%(75/95),特异度为77.61%(52/67),约登指数为0.566,见图1。

3 讨论

3.1 EETs与CVA发病有关

CVA是导致慢性咳嗽的最主要原因,好发于学龄前期和学龄期儿童,由于缺乏典型的喘息、气促等哮喘症状或体征,临床上难以与支气管炎或呼吸道感染鉴别,该病主要临床表现为阵发性夜间咳嗽,不伴喘鸣,通过激素治疗可缓解咳嗽症状[5-6]。EOS来自骨髓造血干细胞,含有大量细胞内颗粒,这些颗粒可活化中性粒细胞和肥大细胞,增强Th2免疫应答,在气道高反应性和组织重塑中起重要作用[7]。已知EOS可通过胞吐、脱颗粒、细胞溶解方式释放次级颗粒。近年来研究发现,除上述方式外,EOS还可以弹出载有特定EOS颗粒蛋白的线粒体DNA,或释放富含染色质的细胞外诱捕网,这一过程称为EOS诱捕网的形成(eosinophil extracellular trap cell death,EETosis),这一网状结构被称为EETs[8]。EETs是一种DNA纤维和细胞毒性颗粒蛋白组成的复杂网状结构,内包含分泌性嗜酸性粒细胞颗粒,在EOS死亡后可继续提供免疫调节、促炎和其他免疫致病刺激,DNA纤维则可吞噬体型较大寄生虫,增加气道分泌物黏性,DNA骨架上聚集大量分泌型颗粒,不易被巨噬细胞清除,EETs外层包裹组蛋白分子,不易被内源性蛋白酶消化,可稳定存活7d[9]。自2008年Yousefi等[10]首次发现克罗恩病患者肠黏膜中存在EETs以来,已有多数研究证实EETs与哮喘[11]、变应性支气管肺曲霉病[12]、慢性阻塞性肺疾病[13]等多种慢性气道疾病也存在密切关联。本研究发现,CVA组患儿外周血形成EETs的EOS百分比明显高于对照组,说明EETs可能也参与了CVA的发病过程。

3.2 EETs与CVA患儿Th1/Th2比值失衡有关

本研究显示,外周血形成EETs的EOS百分比与Th2细胞占比及血清IL-4、IL-6水平均呈正相关,与Th1细胞占比、Th1/Th2比值、IL-2、IFN-γ均呈负相关,表明外周血EETs的形成与CVA患儿Th1/Th2比值失衡、Th2过度活化介导的炎症反应有关。免疫失调与炎症反应是CVA发病的主要基础,Th反应失衡,使以Th2为主的免疫反应介导的细胞因子分泌增多,启动了免疫级联激活反应,导致IgE产生的增加,促进了EOS生长分化,气道黏液分泌物增加,诱发气道炎症反应,进而促使CVA发生和进展[14]。EETs可通过卷曲螺旋结构域25-整合素连接激酶-蛋白激酶Cα-CRTC1通路激活肺神经内分泌细胞,肺神经内分泌细胞通过神经肽和神经递质放大过敏性免疫反应,增加杯状细胞增生、黏液产生、炎症细胞浸润和Th2型细胞因子表达[11]。EETs还可引发不受控制的中性粒细胞诱捕网形成,间接促使呼吸道炎症性损伤[13]。

3.3 EETs与CVA患儿小气道功能下降有关

本研究显示,形成EETs的EOS百分比与FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～FEF75%均呈负相关,表明外周血EETs的形成与CVA患儿小气道受损有关。EETs会诱导有毒颗粒蛋白释放和与损伤相关的分子模式激活,促使气道上皮损伤,降低黏液清除率[12]。EETs的DNA骨架可增加气道局部分泌物黏稠度,导致支气管阻塞和小气道功能障碍[15]。EETs参与CVA小气道损伤也可能通过介导Th1/Th2比值失衡,引起Th2过度活化和炎症反应。推测可能的机制为:首先,EETs游离颗粒内含有阳离子蛋白,可诱导气道上皮细胞脱落,破坏气道上皮完整性和防御功能,并调节气道上皮免疫应答,促使炎症反应[16];其次,EETs可直接刺激气道上皮细胞释放IL-33、IL-1α、IL-1β、IL-5等众多细胞因子,加剧气道炎症损伤,同时IL-5可活化EOS,促使EETs释放,形成相互促进的正反馈通路,加剧气道炎症反应[17];再次,EOS含有大量细胞质夏科-莱登晶体(charcot-leyden crystals,CLCs),在EETosis过程中伴随EETs释放到外周血中[18],而CLCs可促使Th2细胞分化,诱导Th2型气道炎症[19]。由此可见,EETs可能引起Th2介导的炎症反应,最终导致小气道损伤和功能障碍。

3.4 EETs鉴别诊断CVA的价值分析

本研究中经ROC曲线分析结果显示,外周血形成EETs的EOS百分比诊断CVA的AUC为0.760,灵敏度为78.95%,特异度为77.61%,表明EETs在CVA诊断中具有较高的价值,可作为CVA的潜在标志物,对临床诊断和治疗有着积极的意义。

综上,CVA患者外周血形成EETs的EOS百分比显著增高,高外周血形成EETs的EOS百分比与CVA患儿Th1/Th2比值失衡、以Th2免疫反应为主的炎症反应及小气道损伤有关。EETs有望成为CVA的新标志物,通过抑制EETs的形成可能是治疗CVA的一种新方法。