基于超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱建立鸡肉中双酰胺类和双酰肼类农药残留分析方法

张朋杰,卢俊文,张宪臣,李勇,黄碧嘉,曾苑嫦,卢柏淇

(中山海关技术中心,广东 中山,528403)

双酰胺类杀虫剂作为鱼尼汀受体调节剂,通过破坏钙离子通道影响害虫肌肉收缩,导致行动受阻,进而使得害虫死亡,具有作用机理独特、杀虫活性强以及杀虫谱广的特点[1];双酰胺类农药在土壤中的残留期较长,移动性也较强,长期大量施用可能会产生富集作用,氟苯虫酰胺及其脱碘代谢物会对水生无脊椎动物造成急性和慢性风险,威胁到水生食物链 (尤其鱼类),硫虫酰胺和环溴虫酰胺对鱼类和藻类高毒,该类农药可能对水生生态环境造成潜在威胁[2];双酰肼类杀虫剂属蜕皮激素类似物,主要通过诱导昆虫提前蜕皮,发育成熟不完全,抑制其进食来达到灭杀作用,具有用药量少、选择性高等特点[3];甲氧虫酰肼在使用初期被普遍认为对人畜毒性较低且对环境安全,在世界范围内被迅速推广,然而随着甲氧虫酰肼大量广泛使用,越来越多的研究证明其具有残效期长、且毒性较高、对地下水和水生生物具有极高的毒性风险[4]。由于这两类农药在防治农业害虫和城市卫生害虫上得到广泛应用,这些农药的残留会对养殖业相关的饲料、水体、土壤造成污染,从而在动物体内积累,进一步影响人类的身体健康,因此关注动物产品中的农药残留很有必要。为保障食品安全各国对农药残留实施严格的监控,如日本肯定列表规定鸡肉中最大残留甲氧虫酰肼0.01 mg/kg、虫酰肼0.02 mg/kg;欧盟规定鸡肉中氯虫苯甲酰胺、环丙虫酰胺、氟苯虫酰胺、甲氧虫酰肼最大残留0.01 mg/kg,虫酰肼最大残留0.02 mg/kg;我国GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定禽肉中最大残留氯虫苯甲酰胺0.01 mg/kg,溴氰虫酰胺、虫酰肼最大残留0.02 mg/kg。

当前测定双酰胺类和双酰肼类农药残留量的方法主要有气相色谱法[5]、液相色谱法[6-7]和液相色谱-串联质谱法[8-13],检测以蔬菜、水果、油料为主,仅有少量报道是关于动物源性食品的[14-15];同时检测双酰胺类和双酰肼类农药的研究报道较少,目前仅涉及溴虫氟苯双酰胺、氯氟氰虫酰胺、四唑虫酰胺[16-18]。超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)具有分辨率高、定性定量能力好的优点[19-21],可用目标物母离子精确质量数的丰度值直接定量,避免低分辨质谱易受基质干扰而产生假阳性的现象,近年来在检测工作中得到快速应用。本研究结合分散净化技术,用UPLC-Q-Orbitrap HRMS建立同时测定鸡肉中8种双酰胺类和5种双酰肼类农药的残留分析方法,扩大了可同时检测农药的数量,方法具有操作简便、快速、精确的特点,在5、10、50 μg/kg 3个不同加标水平下的平均回收率为90.1%～117.7%,相对标准偏差为1.2%～8.6%,检出限为0.2～1.0 μg/kg,可为鸡肉中双酰胺类和双酰肼类农药残留的例行检测、风险评估等提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈(色谱纯),Merch公司;无水硫酸镁(色谱纯),上海麦克林公司;乙酸铵、PSA、C18、石墨化碳黑(graphitized carbon black, GCB)、陶瓷子(长2 cm×直径1 cm)、0.22 μm微孔滤膜,上海安谱公司;氯化钠(分析纯),广州化学试剂厂。

标准品：溴虫氟苯双酰胺、氯氟氰虫酰胺、环丙虫酰胺、四唑虫酰胺、环虫酰肼(纯度≥95%),德国Dr.Ehrenstorfer 公司;氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、氟苯虫酰胺、四氯虫酰胺、甲氧虫酰肼、虫酰肼、抑食肼、呋喃虫酰肼(质量浓度1 mg/mL),上海安谱公司。

标准溶液配制：准确称取约5 mg(精确至0.01 mg)固体农药标准品分别用乙腈溶解并定容至5 mL,制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液,液体标准品直接开瓶作为储备液,于-18 ℃保存。混合标准工作溶液：吸取适量上述标准储备液,用乙腈稀释配成质量浓度为1 μg/mL的混合标准工作溶液,于-18 ℃保存。

1.2 仪器与设备

Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪、UltiMate3000超高效液相色谱,Thermo公司;3-16KL台式冷冻离心机、CP255D电子天平,赛多利斯公司;超纯水系统,Millipore公司;涡旋振荡器,IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱-质谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm);流动相：乙腈(A)和0.002 mol/L乙酸铵溶液(B);梯度洗脱程序：0～1 min,10% A～40% A,1～8 min,40% A～90% A,8～10 min,保持90% A,10～10.1 min,90% A～10% A;10.1～12 min,保持10% A。流速：0.3 mL/min;柱温：40 ℃;进样量：10 μL。

离子源喷雾电压为3.2 kV,毛细管温度为320 ℃,鞘气流速为40 L/min,辅助气流速为10 L/min,辅助气加热温度为350 ℃。扫描模式为Full scan/dd-MS2,采集范围为100～800 Da,全扫描分辨率为70 000 FWHM,据依赖子离子扫描分辨率为17 500 FWHM,质谱信息见表1。

表1 双酰胺类和双酰肼类农药的保留时间和质谱信息Table 1 Retention times and mass parameters of diamide and dihydrazide pesticides

1.3.2 样品处理

准确称取5.00 g样品于50 mL离心管中,加入5 mL水涡旋振荡30 s,使样品充分分散,再加入10 mL 1%(体积分数,下同)醋酸乙腈,振荡提取2 min;加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠和1颗陶瓷子立即摇散,振荡1 min,在4 ℃下以4 000 r/min转速离心5 min;定量吸取3 mL上清液至内含450 mg无水硫酸镁、50 mg C18和100 mg PSA的离心管中,涡旋混匀1 min;4 200 r/min离心5 min,吸取上清液过微孔滤膜,上机测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

与三重四极杆低分辨质谱分辨力不足仅能将离子质量数准确到小数点后1位、易受m/z近似离子干扰不同,四极杆静电场轨道阱的高分辨率能够将离子质量数准确到小数点后5位,质谱峰宽显著小于三重四极杆低分辨质谱,可区分相同质量数的不同离子,分辨能力强。高分辨质谱的Full scan/dd-MS2扫描模式可每次对一个母离子的所有碎片离子进行全扫描,监测精度高、图谱信息全,定性准确度高,且无需事先对目标物逐个确定离子对和优化碰撞能量。对质量浓度为100 ng/mL的双酰胺类和双酰肼类农药混合标准溶液,在m/z100～800内用高分辨质谱的Full scan/dd-MS2扫描模式进行正负离子扫描,一级全扫描(full scan)分辨率为70 000 FWHM,数据依赖扫描(dd-MS2)分辨率为17 500 FWHM,13种农药母离子精确质量数的实测值与理论值误差均在4.04×10-6范围内,质量误差、信号强度和信噪比详见表1。以各农药母离子精确质量数建立目标列表,当一级全扫描过程中发现目标列表中的离子信号强度超过预设值时触发数据依赖扫描,获得二级碎片全扫描信息。选择一级全扫描的母离子作为定量离子,选择2个具有代表性的二级碎片离子作为定性离子。通过上述质谱参数优化和筛选建立包括农药名称、分子式、离子形式、保留时间、精确质量数及特征碎片离子质谱扫描数据库,详见表1。

2.2 色谱条件的优化

选择3款色谱柱考察对13种农药的分离效果,Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm)色谱柱的填料具有实心核和多孔层的特点,能够限制化合物的扩散距离,提高分离速度,Waters Atlantis T3 (150 mm×2.1 mm, 3 μm) 色谱柱对极性化合物保留能力强,在水流动相中性能稳定,低pH条件下色谱柱寿命长,Ultra AQ C18(100 mm×2.1 mm, 3 μm) 色谱柱适合极性大的化合物,其键合技术能够减弱由于硅羟基封闭不完全而引起的色谱峰拖尾现象。有机相选择乙腈,水相选择水、0.05%(体积分数)甲酸水溶液、0.002 mol/L乙酸铵溶液。结果表明,低浓度的甲酸、乙酸铵可以有效改善色谱峰的分离度和灵敏度,对负离子化合物的响应值抑制较小,当使用乙腈和0.002 mol/L乙酸铵溶液作为流动相时,13种农药均可取得较好的响应值;在相同的梯度洗脱条件下,同分异构体化合物环虫酰肼、呋喃虫酰胺(m/z395.23292)在Waters Atlantis T3、Agilent Poroshell 120 EC-C18上的分离效果要优于Ultra AQ C18,在3款色谱柱上的分离度依次为1.97、1.93、1.31;13种农药中除了四氯虫酰胺、呋喃虫酰肼、抑食肼之外,其他农药在Agilent Poroshell 120 EC-C18上的离子响应强度均优于Waters Atlantis T3。因此,从分离度和离子响应强度综合考虑,选择Agilent Poroshell 120 EC-C18为本研究使用的色谱柱(图1)。

a-正离子色谱图;b-负离子色谱图图1 双酰胺类和双酰肼类农药的正、负离子色谱图

图2 不同吸附剂组合对农药回收率的影响

2.3 提取净化方法的优化

2.3.1 萃取剂的选择

实验比较了乙腈、1%甲酸-乙腈、1%醋酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%醋酸-乙腈5种提取溶剂对双酰胺类和双酰肼类化合物的提取效果,添加量为10 μg/kg的空白鸡肉样品分别按照实验方法处理,13种农药的回收率为：乙腈89.5%～99.2%、1%甲酸-乙腈为85.6%～107.4%、1%醋酸-乙腈为94.3%～106.5%、0.1%甲酸-乙腈为85.7%～96.5%、0.1%醋酸-乙腈为89.7%～102.2%,1%醋酸-乙腈的提取效率总体情况最好,因此采用1%醋酸-乙腈作为提取溶剂。

2.3.2 水化量的优化

由于乙腈具有一定的沉淀蛋白作用,直接加入会导致鸡肉有一定程度结块,不利于农药的充分提取,加入一定量的水使其充分分散后再进行有机溶剂提取可提高萃取效率。在10 μg/kg 的添加水平下,在鸡肉中分别加入1、3、5、7 mL水,涡旋振荡30 s,然后分别按照实验方法处理上机测定,通过回收率对比以确定适合鸡肉的最优水化量。结果表明,加入1 mL水时,四氯虫酰胺的回收率为83.3%,低于其他3种情况;当加水量为3、5、7 mL时,结果差异性并不显著,13种农药的回收率依次为92.2%～103.9%、92.9%～105.0%、92.1%～103.6%,5 mL的数据略微优于3 mL和7 mL的数据,因此研究采取5 mL作为加水量。

2.3.3 萃取盐包的选择

萃取盐包的加入可以起到盐析、调节pH作用,能够提高萃取的效率,常见的萃取盐有硫酸镁、氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠等,在10 μg/kg 的添加水平下,按照方案1：4 g硫酸镁和1 g氯化钠;方案2：6 g硫酸镁和2 g氯化钠;方案3：6 g硫酸镁和1.5 g醋酸钠;方案4：4 g硫酸镁、1 g 氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠,来探究适合鸡肉的最优萃取盐包组成。结果表明,在加入盐包后方案1、3的放热高于方案2、4;各方案农药的回收率分别是：方案1为96.8%～108.0%、方案2为92.4%～103.8%、方案3为91.3%～102.2%、方案4为89.1%～99.3%,方案1各农药的回收率是4个方案中最好的,仅有环虫酰肼、四唑虫酰肼的回收率出现低于其他方案的情况,所以采用方案1作为本研究的萃取盐包。

2.3.4 净化条件的优化

通过分散吸附的方式使吸附剂与样品中的基质杂质相互作用以达到净化效果,常用的吸附剂有PSA、C18、GCB等。PSA常用来吸附色素、糖和脂肪酸等极性基质成分;C18是非极性吸附剂,能够吸附非极性干扰物,如蛋白、脂质物质等。研究在除水剂无水硫酸镁用量为450 mg时,PSA、C18、GCB不同使用量的净化效果,设计8种吸附剂组合,组合1：100 mg PSA+50 mg C18;组合2：100 mg PSA+100 mg C18;组合3：100 mg PSA+150 mg C18;组合4：50 mg PSA+100 mg C18;组合5：150 mg PSA+100 mg C18;组合6：100 mg PSA+50 mg C18+5 mg GCB;组合7：100 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB;组合8：100 mg PSA+50 mg C18+15 mg GCB,以阴性鸡肉样品加标量10 μg/kg考察净化效果。对比组合1～5的加标回收率,组合1的回收率优于其他组合;在组合1的基础上分别加入5、10、15 mg GCB,净化后溶液颜色变得更加清澈,但与组合1相比多数农药的回收率均有所下降,推测是GCB的平面结构在吸附色素的同时对具有苯环结构的双酰胺类、双酰肼类农药也有一定程度的吸附的原因,因此本研究采用450 mg无水硫酸镁、100 mg PSA和50 mg C18为最终的净化剂组合。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法的线性范围和检出限

吸取适量的混合标准工作溶液,用空白基质溶液稀释成一系列浓度的标准溶液,用高分辨质谱测定。以定量离子峰面积对质量浓度进行线性回归,绘制标准曲线,13种农药的线性范围和相关系数详见表2。高分辨质谱的基线噪音极低,不能用传统的信噪比计算检出限,本文用空白基质溶液逐级稀释标准溶液,直至仪器能检出最低浓度情况下连续测试10次,计算检测结果的标准偏差(s),以3s作为方法的检出限,13种农药的检出限为0.2 ～1.0 μg/kg,详见表2。

表2 13种农药的线性范围、标准曲线方程、相关系数、检出限、回收率和精密度(n=6)Table 2 Linear ranges, linear equation, correlation coefficient, LOD, spiked recoveries, and RSD of 13 pesticides(n=6)

2.4.2 方法的准确度和精密度

采用标准加入法,取混合标准溶液在阴性鸡肉样品中添加5、10、50 μg/kg三个浓度水平进行回收率实验,每个水平测试6次,测得13种农药加标平均回收率为90.1%～117.7%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.2%～8.6%(表2),符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中检测方法确认技术要求中关于回收率、精密度的要求。

2.4.3 实际样品测定

收集市场和超市上不同品种的鸡肉20批次,利用本方法进行测定,未检出双酰胺类和双酰肼类农药。

3 结论

通过对色谱质谱条件、提取试剂、水化量、萃取盐包以及净化剂组成的优化,本文建立了一种同时测定鸡肉中双酰胺类和双酰肼类农药的超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱方法,方法具有操作简单、检测效率高的特点,其方法灵敏度、线性范围、相关系数、准确度及精密度等均满足国内外法规对农药残留检测的要求,为鸡肉中双酰胺类、双酰肼类农药残留的检测提供了新方法,为监管部门的例行检测、风险评估等提供了技术支撑。