植物叶片悬浮培养的研究

安惠韬 王茜 王瑞刚

收稿日期：2023-11-28

* 基金项目：呼和浩特市重大科技专项（2022-社-重-1-3）、科技创新团队（NMGIRT2222和BR22-13-05）

第1作者：安惠韬（1998-），  男，  硕士研究生，  主要研究方向：  植物生物化学与分子生物学。

**通訊作者：王瑞刚（1972-），  男，  教授、  博士生导师，  主要研究方向：  植物生物化学与分子生物学

引文格式：安惠韬，  王茜，  王瑞刚.  植物叶片悬浮培养的研究［J］.  林业科技，  2024，  49（1）：  29 - 33.

DOI ： 10. 19750 / j. cnki. 1001 - 9499. 2024. 01.  007

摘要：  对于植物为适应胁迫环境的生理变化及其适应胁迫环境能力的研究是近年来的热点问题。渗透调节机制是植物适应胁迫环境的主要生理机制，其中植物叶片细胞渗透势的测定与研究是确定植物渗透调节能力的关键。本研究以拟南芥、柠条、落叶松为研究对象，经过梯度浓度蔗糖溶液培养，以质壁分离现象的发生为标准测定植物叶片细胞渗透势。通过显微镜观察发现，拟南芥、柠条、落叶松叶片细胞等渗浓度分别为0.375、0.575、0.825 mol/L（蔗糖溶液）。计算得出，拟南芥、柠条、落叶松叶片细胞渗透势分别为-921.3、-1 412.66、-2 026.86 kPa。对南芥、柠条、落叶松等植物叶片细胞渗透势的测定，有利于提高植物组织培养效率、提高植物植物存活率。同时，为植物渗透调节机制的研究、优良品种的选育提供理论依据。

关键词：  拟南芥；  柠条；  落叶松；  质壁分离；  渗透势； 等渗

中图分类号：   S 512. 1; Q 95; Q 71               文献标识码：   A                文章编号：１００1 － 9499（２０24）01 － 0029 － 05

Research on Isotonic Suspensions of Plant Leaves

AN Huitao WANG Qian WANG Ruigang**

（ Inner Mongolia Key Laboratory of Plants Adversity Adaptation and Genetic Improvement in Cold and Arid Regions，   Inner Mongolia Hohhot 010018）

Abstract Research on the physiological changes in plants to adapt to stressful environments and their ability to adapt to stressful environments has been a hot issue in recent years. Osmoregulation is the main physiological mechanism for plants to adapt to stressful environments， among which the determination and study of the osmotic potential of plant leaves is the key to determine the osmoregulatory capacity of plants. In this study， the osmotic potential of plant leaves was determined by the occurrence of the phenomenon of plasmatic wall separation after incubation with a gradient concentration of sucrose solution using arabidopsis， lemongrass and larch as the subjects. The isotonic concentrations of Arabidopsis thaliana， Caragana microphylla and Larix gmelinii were 0.375， 0.575 mol/L and 0.825 mol/L （sucrose solution） respectively. The calculated cellular osmotic potential was -921.3， -1 412.66， and -2 026.86 kPa for Arabidopsis， lemongrass， and Larix gmelinii， respectively. The determination of the osmotic potentials of the leaves of Arabidopsis thaliana， Caragana korshinskii microphylla and Larix gmelinii was useful for improving the efficiency of plant tissue culture and plant survival. At the same time， it provides theoretical basis for the study of osmoregulation mechanism of plants and the selection and breeding of excellent varieties.

Key words Arabidopsis thaliana; Caragana korshinskii; Larix gmelinii; plasmolysis; osmotic potential; isotonic

渗透调节（Osmoregulation， osmotic adjustment）是指细胞通过增加或减少溶质以降低或提高渗透势的调节作用[ 1 ]，是植物维持无机离子适当浓度的关键。渗透调节的含义是指植物通过新陈代谢活动增加细胞内溶质浓度，降低渗透势（即水势），继续从细胞外介质中吸收水分以维持一定的膨胀压力，使得其在干旱、盐碱等胁迫环境下保持较正常的代谢活动[ 2 ]。在干旱条件下，参与植物细胞渗透调节的主要物质是渗透调节无机离子K+、Ca2+、Mg2+以及渗透调节有机物质可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等[ 3 - 4 ]。在水分胁迫作用下，植物会降低其细胞渗透势即水势，而其渗透调节机制则通过保持膨胀压力来维持其稳定性，进而维持植物叶片细胞气孔的传导性，并且保护光系统的正常功能，维持光合作用光化学活性，保证光合作用的正常进行[ 5 ]。因此，渗透调节是植物重要的抗逆生理机制，是植物通过降低渗透势适应盐胁迫[ 6 ]、干旱胁迫[ 7 - 8 ]、水分胁迫等影响植物生长发育的逆境[ 9 ]，同时对植物的正常生理代谢活动与生长发育都有着重要作用。

植物可以在胁迫环境下继续生长，依赖于较为复杂的渗透势调节机制[ 10 ]。通常认为，等渗环境下植物组织用于调节细胞渗透压的能量最少，有利于植物的生长发育。测定植物细胞与组织渗透势的常用方法包括质壁分离法、冰点降低法和蒸汽压力降低法等[ 11 ]。本研究拟用本实验室常用实验植物拟南芥（Arabidopsis thaliala）为草本植物代表、柠条（Caragana sinica）为灌木代表、落叶松（Larix gmelinii）为乔木代表，此三者作为研究材料，通过植物细胞质壁分离实验，确定植物组织的等渗点。植物组织渗透势的研究及确定对拟南芥、柠条、落叶松等植物生理代谢机制、抗逆机制的研究有重要意义，并且为植物组织培养技术、植物生理代谢活动及细胞内物质稳态的研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1. 1 实验材料

本研究所用实验材料拟南芥、柠条、落叶松均由内蒙古农业大学旱寒区植物逆境适应与遗传修饰改良自治区重点实验室提供。

1. 2 梯度浓度蔗糖溶液的配置

1 mol/L蔗糖溶液（母液）：称取34.2 g预先在60～80 ℃条件下烘焙至恒重的蔗糖置于100 mL容量瓶中，随后使用蒸馏水溶解并定容至100 mL。用1 mol/L蔗糖溶液（母液）依C1V1=C2V2公式配置成以0.05 mol/L為浓度差，0.30～0.70 mol/L为范围的系列梯度浓度的蔗糖溶液，将配置好的梯度浓度蔗糖溶液贮于小试剂瓶中。取9套干燥洁净的培养皿编号标注，将配制好的梯度浓度蔗糖溶液按顺序加入各培养皿中，使溶液成一薄层。

1. 3 植物叶片的处理及表皮细胞的液体悬浮培养

选择生长状况良好，无斑点、无虫蛀的植物叶片，获取其植物叶片表皮。所取材料应尽量保持处于同一植株部位，并且撕取叶片表皮细胞时应避开叶片主脉，取用其他部位。为了有良好的观察效果，获取植物叶片表皮细胞时应尽量去除叶肉部分，仅保留表皮细胞。因拟南芥、柠条的植物叶片较为幼嫩撕取较为困难，需选取生长周期长的植株或颜色较深的老叶片，用镊子撕取其表皮。而落叶松叶片的表皮较难大面积撕取，可使用刀片刮去其中一面表皮与全部叶肉细胞。将获取的植物叶片表皮，立即分别浸入准备好的培养皿中浸泡20～30 min。同时记录室温。

1. 4 显微镜玻片的制备及观察

从低到高浓度依次取出材料，放在滴加对应浓度蔗糖溶液的载玻片上并编号标注，盖好盖玻片。将制备好的玻片置于显微镜下，观察各玻片的植物细胞是否发生质壁分离现象。若在两个相邻浓度的材料中，一个没有发生质壁分离或质壁分离细胞数不足50%，则该浓度即没有引起细胞发生质壁分离的最高外液浓度；另一个发生质壁分离的细胞数超过50%，则该浓度即引起细胞发生质壁分离的最低外液浓度。此时，对这两个浓度取平均值后的结果即可作为本材料叶片细胞的等渗浓度。

1. 5 细胞渗透势（ΨS）的计算

将所得的等渗浓度和记录的室温带Van Hoff公式ΨS= -icRT，计算出细胞等渗溶液的渗透势即细胞的渗透势（ΨS）。式中，ΨS为溶液的渗透势力（与细胞的渗透势相等）；c为等渗浓度（mol/L）；R为摩尔气体常量[（0.0083 L·MPa）/（mol·K）]；T为热力学温度（K），即273+t℃（实验时温度）；i为溶液溶质的解离系数（蔗糖i=1）。

2 结果与分析

2. 1 拟南芥叶片表皮细胞质壁分离现象的显微镜观察

成熟植物细胞水势Ψ=ΨS+ΨP+ΨM[ 12 ]。衬质势（ΨM）是由于细胞胶体物质亲水性和毛细管对自由水的束缚而引起的水势降低值。由于已经形成中心大液泡的细胞含水量很高，衬质势只占整个水势的微小部分，通常一般忽略不计。渗透势（ΨS）是指因溶质的存在而使水势降低的值。溶液渗透势决定于溶液中溶质颗粒总数，故渗透势以负值表示。压力势（ΨP）是指细胞吸水膨胀时原生质向外对细胞壁产生膨压，而细胞壁向内产生的反作用力引起的细胞水势增加的值，一般为正值。当细胞失水时，细胞膨压降低，原生质体收缩，压力势则为负值。当刚发生质壁分离时压力势为零。因此，在测定植物细胞水势时ΨP、ΨM可忽略不计[ 13 ]。本研究中，选用质壁分离法来测定植物细胞的渗透压。活细胞的原生质膜具有选择性渗透功能，细胞内外物质的进出都由其控制，它对于水具全透性，但对于某些溶质的透性则较低。当植物组织被置于一定浓度的某溶液中时，其细胞内外的水分便可根据水势梯度的方向发生迁移，从而通过过原生质膜。当外液浓度低时，细胞内渗透压将升高，胞外溶液中的水则进入细胞内；而当外液浓度较高时，细胞内渗透压降低，细胞内的水分则向外渗出，从而发生质壁分离。当细胞在一定浓度的外液中刚刚发生质壁时，细胞的压力势等于零。此时，细胞的渗透势等于细胞的水势。该溶液即称为细胞或组织的等渗溶液，其浓度称为等渗浓度。根据Van Hoff公式ΨS=-icRT[ 14 ]，即可计算出植物细胞的渗透势。

拟南芥在蔗糖溶液浓度为0.35 mol/L时未发生质壁分离现象，在蔗糖溶液浓度为0.40 mol/L时发生质壁分离现象的细胞数超过50%（图1）。因此取平均值得到拟南芥叶片表皮细胞发生质壁分离现象的等渗浓度为0.375 mol/L。此时室温为23 ℃。

2. 2 柠条叶片表皮细胞质壁分离现象的显微镜观察

柠条在蔗糖溶液浓度为0.55 mol/L时未发生质壁分离现象，在蔗糖溶液浓度为0.60 mol/L时发生质壁分离现象的细胞数超过50%（图2）。因此取平均值得到拟南芥叶片表皮细胞发生质壁分离现象的等渗浓度为0.575 mol/L，此时室温为23 ℃。

图2 柠条叶片表皮细胞质壁分离现象

注：A：0.55 mol/L蔗糖溶液下细胞未发生质壁分离；B：0.60 mol/L蔗糖溶液下细胞发生质壁分离

2. 3 落叶松叶片表皮细胞质壁分离现象的显微镜观察

落叶松在蔗糖溶液浓度为0.80 mol/L时未发生质壁分离现象，在蔗糖溶液浓度为0.85 mol/L时发生质壁分离现象的细胞数超过50%（图3）。因此取平均值得到拟南芥叶片表皮细胞发生质壁分离现象的等渗浓度为0.825 mol/L，此时室温为23 ℃。

图3 落叶松叶片表皮细胞质壁分离现象

注：A：0.80 mol/L蔗糖溶液下细胞未发生质壁分离；B：0.85 mol/L蔗糖溶液下细胞发生质壁分离

2.4 细胞渗透势（ΨS）的计算

拟南芥叶片表皮细胞发生质壁分离现象的等渗浓度为0.375 mol/L，室温为23 ℃，将其带入Van Hoff公式ΨS= -icRT得到拟南芥细胞渗透势为-921.3 kPa。

柠条叶片表皮細胞发生质壁分离现象的等渗浓度为0.575 mol/L，室温为23 ℃，将其带入Van Hoff公式ΨS= -icRT得到拟南芥细胞渗透势为-1 412.66 kPa。

落叶松叶片表皮细胞发生质壁分离现象的等渗浓度为0.825 mol/L，室温为23 ℃，将其带入Van Hoff公式ΨS= -icRT得到拟南芥细胞渗透势为-2 026.86 kPa。

3 结论与讨论

植物具有固着附生的特性，因此周围持续变化的多种环境条件极易形成胁迫环境，影响植物的生长发育甚至造成植物死亡。例如，病原体感染、食草动物的啃食等生物胁迫，以及干旱、高温、冷、营养匮乏、盐碱、有毒金属等非生物胁迫都对植物的生长、发育有着重要影响。土壤中的高浓度盐分会对植物形成胁迫环境，会降低植物根部细胞的水势，破坏根部细胞内的离子平衡，进而导致植物根部无法正常吸收水分，引起植物体内的离子稳态失衡，从而影响植株对其他离子的吸收以及植株的正常生长。渗透胁迫是指由于环境因素的变化使植物得不到充足水分的一种状况。植物体内的渗透压低于环境渗透压（如土壤溶液），植物体不能吸水甚至失水，最终可导致死亡。常见的渗透胁迫因素有干旱、盐害及冻害等。在胁迫环境下，植物通过调节细胞的渗透势来控制水分流失，从而维持细胞膨胀[ 1 ]，进而来维持植物的正常生理生命活动，如细胞的正常生长、气孔开放以及光合作用等生理过程。

生物膜结构与功能的适应、细胞质膜透性的变化、渗透调节作用、气孔调节作用、逆境诱导蛋白及基因表达、激素调节、过氧化作用等生理机制是植物抵抗胁迫环境的主要途径。目前，渗透调节是国内外抗性生理研究的热点问题。植物往往通过渗透调节这一主动调节方式，适应干旱胁迫、盐胁迫[ 6 ]、水分胁迫等影响植物生长发育的逆境。渗透调节是植物在干旱[ 7 ]、涝或盐渍等胁迫条件下，通过代谢活动增加细胞内溶质的浓度，降低渗透势（即水势），并从细胞外的介质中吸收水分，从而维持正常的生理代谢过程[ 2 ]，如细胞生长、气孔开放和光合作用等，并保持较正常的生理代谢活动。在逆境条件下，渗透调节物质的积累对植物细胞维持正常细胞膨压、调节细胞内溶质的浓度、促进光合作用等都有重要作用。因此渗透调节对植物的正常生理代谢活动与生长发育都有着重要作用。这有利于叶肉细胞间隙保持较高水平的CO2含量，从而避免或减少其细胞内的光合器官受到光抑制作用的影响。

在植物细胞外液的浓度产生变化时，其细胞内溶质浓度改变，从而其渗透压也会发生相应的变化。当植物叶片表皮细胞内溶液浓度小于细胞外溶液浓度时，细胞内渗透压降低，细胞失水皱缩，发生质壁分离现象。当植物叶片表皮细胞内溶液浓度大于细胞外溶液浓度时，细胞内渗透压增高，细胞吸水膨胀，质壁分离复原。在等渗条件下，细胞内外溶液浓度相等，此时植物用于渗透调节机制的能量最少。在能量消耗最少的状态下，植物的组织培养与生长发育效率更高。对于植物细胞等渗点的确定，在一定程度上可以减少植物的能量消耗，增快植物的培养效率。本研究对植物在胁迫环境下的渗透调节机制进行了研究与分析，并通过质壁分离法确定了拟南芥、柠条、落叶松的叶片表皮细胞等渗点。通过上述研究，得到如下结论：拟南芥叶片表皮细胞渗透势为-921.3 kPa；柠条叶片表皮细胞渗透势为-1 412.66 kPa；落叶松叶片表皮细胞渗透势为-2 026.86 kPa。

干旱、盐胁迫及低温等非生物逆境导致渗透胁迫造成作物生产的损失，对粮食安全有重要影响。众所周知，干旱、盐碱、高/低温胁迫是影响全球植物地理分布、限制农作物产量、制约经济发展，甚至威胁粮食安全的主要环境因子。近年来，伴随极端天气的频繁出现，非生物胁迫对农作物产量以及农业发展的不利影响愈发严重。干旱是制约生态环境、地区经济发展、人类生存和植物分布的一个常见的主要因素。在全球范围内，干旱和半干旱地区约占土地面积的35%[ 1 ]，且这种趋势每年都在增加。此外，干旱是造成作物减产的主要原因，且干旱造成的作物减产程度甚至高于其他环境因素造成的作物减产总和[ 1 ]。对于植物如何识别、响应胁迫环境这一科学问题的研究也是近年来广受科学家们关注的科学问题。植物因其固着生长的特性而难以躲避所受到的渗透胁迫，被迫进化出感知和适应逆境的机制，主要包括信号接收与传导、植物激素脱落酸（abscisic acid， ABA）相关调控和后期应答等过程[ 15 - 16 ]。此外，植物在胁迫环境下需要消耗比正常环境下更多的水分和营养物质来抵抗不利于生存的环境，这一问题在农业生产中尤为重要。内蒙古地区位于中国北部边疆，其西部地区具有生态环境较为脆弱、自然灾害较为频繁、土地问题如干旱和盐碱化等较为严重的特点。基于内蒙古地区的土地特点，对植物适应逆境胁迫的渗透调节作用的研究，可以为提高植物抗旱性、提高植物存活率、选育抗旱优良品种提供理论指导。并且，通过提高植物抗逆性应对胁迫环境来降低农业生产中对肥料的需求、节约水资源，进而促进农业生产与生态环境的可持续发展有着重要意义。本研究通过对植物叶片表皮细胞在梯度浓度蔗糖溶液中质壁分离现象的观察，对植物细胞渗透调节机制有了进一步的了解。同时，对拟南芥、柠条、落叶松的叶片表皮细胞等渗点的确定，有利于提高植物培养效率，为提高植物育种、培育效率提供理论指导。

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