3 株酵母菌的鉴定及用于水果采后保鲜初探

宋培勇，张 容，漆杨菊，胡 蓉，王双双，曾 钢

（1.遵义师范学院生物与农业科技学院，贵州 遵义 563006；2.遵义市第八中学，贵州 遵义 563099）

酵母菌是单细胞真核微生物，能发酵糖类产能，故有“糖菌”之称，以出芽生殖为主，细胞壁含葡聚糖和甘露聚糖，常常分布在含糖量较高的酸性环境中。人类与酵母菌关系久远而密切，如白酒的酿造、面包的制作、B 族维生素和单细胞蛋白（SCP）的生产、石油脱蜡、美容抗衰、疫苗生产等。酵母菌除了上述诸多用途外，在生物保鲜方面，酵母作为主要的生物拮抗菌，因不产生毒素、遗传稳定、生长繁殖能力强、可与化学拮抗剂配合使用等特点而成为研究热点[1,2]。目前，运用到果蔬采后病害防治中的拮抗酵母菌约有20 多种，如季也蒙毕赤酵母、罗伦隐球酵母、假丝酵母、隐球酵母、红酵母、季氏假丝酵母、毕赤酵母、柠檬形克勒克酵母等[3]。应用生物拮抗菌对果蔬采后病害进行生物防治是目前最有希望替代化学杀菌剂的一种新型保鲜技术[4]。在人类基因组计划的推动下，1996 年酿酒酵母全基因组测序完成[5]；2018 年中、美科学家更是利用基因编辑技术各自人工合成了仅有1 条和2 条染色体的酿酒酵母[6,7]。这些研究极大地推动了酵母菌基因组学和后基因组学的发展，也为未来通过基因工程改造现有拮抗酵母菌，并最终获得高效广谱拮抗酵母菌株提供了可能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料：酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3，为本实验室从贵州省凤冈县仙人岭采集的水果梨、李和葡萄中分离、纯化并保存。用于测试生物保鲜效果的水果枣和提子从当地市场购买，山桃从遵义师范学院校园中采集。

1.1.2 主要仪器：E200F 型生物数码显微镜（尼康）、Mastercycler nexus gradient 梯度PCR 仪（Eppendorf）、超低温冰箱（BioRad）、PHS-25 型数显PH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、DYY-6C电泳仪（北京六一）。

1.1.3 主要药品及试剂：PCR引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4：5′-GGTC CGTGTTTCAAGACGG-3′（上海生工），100 bp DNA Ladde（r北京天根），Taq PCR Mix(2×（)上海生工）。

1.1.4 主要培养基：YEPD 培养基、麦氏（MeClary）培养基、碳源同化基础培养基和氮源同化基础培养基，参考相关文献[8～10]进行配制。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌形态特征的观察

（1）菌落形态：将斜面保存的XRL-1、XRL-2 和XRL-3，无菌操作转接到YEPD 平板上，28 ℃培养3 d-5 d，观察菌落大小、颜色等形态特征。

（2）细胞形态：用接种环挑取少许酵母菌于滴有无菌水的载玻片上，涂匀，加盖玻片，在微分干涉显微镜下观察，并拍照记录。

（3）子囊孢子：无菌操作将酵母菌转接到麦氏琼脂培养基上，28 ℃培养48 h 后，挑取少许酵母菌于滴有生理盐水的载玻片上，混匀，火焰上方固定，自然风干，以孔雀绿-番红染色法染色后，在普通复式光学显微镜或微分干涉显微镜下观察，拍照并记录结果。

1.2.3 生理生化特性

（1）碳源同化/糖发酵试验。液体培养基的配制：蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、糖（淀粉/乳糖/葡萄糖/蔗糖）1 g、蒸馏水100 mL，pH7.6，113 ℃灭菌30 min。在超净工作台中制作酵母菌悬液，以移液枪接种1 mL 酵母菌悬液于含不同碳源的蛋白胨培养液试管中（内有倒置德汉氏小管），每种碳源各设3 管，另加有各种碳源的培养液各设一不接菌种的试管作为对照组，每一试管中滴入2～3 滴1.6%溴甲酚紫乙醇溶液指示剂，用PHS-25 型数显pH 酸碱计测量后，以1% NaOH 调pH 至7.6，并做好标记，28 ℃培养2～3天。试管中颜色为紫色不产酸，黄色则产酸；德汉氏小管中有气泡则证明能产气，反之则不能。

（2）氮源同化试验。配制氮源同化培养基：硫酸铵0.198 g/尿素0.090 g/蛋白胨3 g/硝酸钠0.127 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾0.2 g，七水合硫酸镁0.2 g，蒸馏水1000 mL，氯化钠0.2 g，碳酸钙5 g，琼脂15～20 g，调节至pH7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min，将菌株接种于平板上，每种菌接3 个平板，28℃培养3～7天。观察菌株生长情况。

1.2.4 模板制备和PCR 扩增

（1）酵母菌基因组DNA 模板制备[11]挑取酵母菌接种于YEPD平板上，28℃培养2 天，经4℃过夜后，按文献报道的方法制备DNA 模板，-20℃保存备用。

（2）26S rDNA D1/D2 区PCR 扩增

PCR 扩增引物为通用引物[12]：NL-1 和NL-4。

PCR 扩增程序[13]：94 ℃3 min；94 ℃40 s，48 ℃45 s，72 ℃45 s，5 个循环；94 ℃40 s，53 ℃45 s，72℃45 s，25 个循环；72 ℃8 min。

1.2.5 PCR 产物测序及系统发育分析

将PCR 产物进行测序（由上海生工完成），将测序结果在NCBI 中进行Blast 比对分析，获得最相近菌株的26S rDNA D1/D2 序列，在MEGA4.1 中以邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树。

根据26S rDNA D1/D2 序列比对和系统发育分析，并结合形态学和生理生化特征[9,14]，对实验菌株进行分类鉴定。

1.2.6 水果生物保鲜试验

选取3 种水果枣子、提子和山桃，每种水果，设3 个试验组（即XRL-1、XRL-2 和XRL-3 处理组）和1 个对照组（即无菌水处理组），每个组设3 个重复，每个重复5 个水果。将XRL-1、XRL-2 和XRL-3 酵母菌YEPD 液体培养物先测其OD600值，用无菌水稀释使各OD600值一致，用无菌烧杯分装，将水果放于盛有酵母菌液的烧杯中浸1 min，整齐摆放在台面上指定位置，然后连续观察记录2 周，以比较酵母菌对水果的保鲜效果，并利用SPSS 统计软件（IBM SPSS Statistics 19）对试验结果做单因素方差分析[15]。

2 结果与讨论

2.1 酵母菌的形态特征

XRL-1 菌落表面湿润光滑，乳白色，大而厚，圆形，边缘整齐1.3mm；呈单个细胞，圆形或椭圆形，长4.3m、宽3.7m；在YEPD培养基上可见芽殖；在麦氏培养基上未见子囊孢子，见图1。

图1 XRL-1 菌落形态及细胞形态（10×100）

XRL -2 菌落表面湿润粘稠，乳白色，圆形或椭圆形，少数形状不规则，从培养基表面微微凸起，边缘整齐或不整齐2.6mm；呈单个细胞，圆形或椭圆形，少数呈扇形，长平均5.4m，宽平均4.2m；在YEPD 培养基上可见芽殖；在麦氏培养基上见子囊孢子，见图2。

图2 XRL-2 子囊孢子（10×100）

XRL-3 菌落表面湿润光滑有光泽，乳白色，圆形或椭圆形，明显突起，边缘不整齐2.4mm；细胞呈柠檬形或卵圆形；在YEPD培养基上可见两极芽殖，在麦氏培养基上未见子囊孢子。

2.2 生理生化特性

碳源同化/糖发酵试验结果表明：4 种供试碳源葡萄糖、乳糖、蔗糖和淀粉，XRL-1 均能利用；XRL-2只能利用葡萄糖和蔗糖；XRL-3 只能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，但对蔗糖利用作用不如葡萄糖和乳糖；葡萄糖是3 株酵母菌均能利用的通用碳源，见表1。

表1 碳源同化/糖发酵及氮源同化结果

氮源同化试验结果表明：4 种供试氮源蛋白胨、尿素、硝酸钠和硫酸铵，XRL-1 和XRL-2 菌株均能利用，但XRL-3 仅能利用蛋白胨，蛋白胨是3 株酵母菌的通用氮源，见表1。

2.3 26S rDNA D1/D2 区PCR 扩增、测序、比对及系统发育分析

利用26S rDNA D1/D2 区PCR 扩增通用引物NL1 和NL4 进行PCR 扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3 所示：XRL-1、XRL-2和XRL-3 均扩增到约600 bp 大小的片段，条带清晰、整齐、明亮，与有关文献[16,17]报道的一致，说明已成功扩增到了目的片段。

图3 酵母菌26S rDNA D1/D2 区PCR 扩增

将PCR 扩增产物测序，进入NCBI 官网进行Blast 比对，结果如表2 所示：XRL-1 与Wickerhamomyces anomalus strain FBKL2.8007 相似性为100.00%，XRL-2 与Saccharomyces cerevisiae isolate LMQA SNR 106 的相似性为99.83%，XRL-3 与Hanseniaspora uvarum strain SC-12 的相似性为99.66%。

表2 26S rDNA D1/D2 区PCR 扩增产物BLAST 比对结果

利用XRL-1、XRL-2 和XRL-3 的26S rDNA D1/D2 区序列和 Wickerhamomyces anomalus strain FBKL2.8007、Saccharomyces cerevisiae isolate LMQA SNR 106 和 Hanseniaspora uvarum strain SC-12 的相应序列，利用Mega4.1 构树软件构建系统发育树，结果如图4 所示，XRL-1、XRL-2和XRL-3与相应的同源菌株聚为一支，同时也可以看出，在3株酵母菌中，XRL-2 和XRL-3 亲缘关系更近。

图4 根据酵母菌26S rDNA D1/D2 区序列构建的系统发育树

根据26S rDNA D1/D2 区序列Blast 比对和系统发育分析，结合形态学和生理生化特征，将试验菌株XRL-1、XRL-2 和XRL-3 分别鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus ）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。

2.4 水果生物保鲜

水果保鲜结果如表3 所示，单因素方差分析表明：酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3 对枣子、提子和山桃的保鲜效果在第一周均无显著性差异（p>0.05）；在第二周对山桃亦无显著差异（p>0.05），但对枣子和提子差异显著（p<0.05），就枣子保鲜效果而言，多重比较表明XRL-1、XRL-2 和XRL-3 与对照组之间以及XRL-1 与XRL-2 和XRL-3 之间差异显著（p<0.05），XRL-2 与 XRL-3 之间差异不显著（p>0.05）；就提子的保鲜效果而言，多重比较表明XRL-1 与XRL-3 和对照组之间差异显著（p<0.05），但XRL-1 与XRL-2 以及XRL-2 与对照组和XRL-3之间差异不显著。提示不同的酵母菌拮抗活性存在明显差异，3 种酵母菌中以异常威克汉姆酵母对枣子和提子的保鲜效果在第二周最佳，这与王远见（2022）[18]和蓝黄博恩（2023）[19]报道的比较一致；第一周无显著性差异可能和酵母菌的接种方法及其水果的定植有关。而山桃无论在第一周还是第二周，3 种酵母菌的保鲜效果并无显著差异，推断可能因为山桃是野生水果，加之不同的水果可能存在不同的微生物区系，引起水果褐变或霉变的致病菌不同，水果中各种抗性酶的活性亦有高低，致使酵母菌对不同水果的保鲜效果各异。

表3 3 株酵母菌对3 种水果的生物保鲜效果（表中数据为褐变或霉变率/%）

3 结论

对从贵州省凤冈县仙人岭李、梨和葡萄3 种水果中分离的3 株酵母菌XRL-1、XRL-2 和XRL-3 开展了形态学、生理生化以及分子生物学鉴定，将XRL-1、XRL-2 和XRL-3 分别鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。3 株酵母菌对水果枣子、提子和山桃采后保鲜的效果并不一致：在枣子采后保鲜上，XRL-1 与XRL-2、XRL-3 与对照组相比，在第一周无显著性差异，但在第二周差异显著（p<0.05）；在提子采后保鲜上，XRL-1、XRL-2 和XRL-3 与对照组相比，在第一周无显著性差异，但在第二周XRL-1 与XRL-3 和对照组之间差异显著（p<0.05）；在山桃采后保鲜上，XRL-1、XRL-2 和XRL-3 与对照组相比，在第一周和第二周均无显著性差异（p>0.05）。用酵母菌作为拮抗菌剂用于果蔬生物保鲜，尚需要进一步深入开展以下研究：拮抗酵母筛选与基因工程改良，拮抗酵母复合菌剂研究，果蔬采后微生物区系变化研究等。