积雪草酸通过调控细胞凋亡和自噬缓解脂多糖诱导肉鸡急性肾损伤的研究

邱文粤,苏依曼,叶嘉莉,章心婷,庞晓玥,王荣梅,谢子茂,张 辉,唐兆新,苏荣胜*

(1.华南农业大学兽医学院,广州 510642;2.韶关学院英东生物与农业学院,韶关 512005;3.黄埔区动物卫生监督所,广州 510799)

急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是由细菌、病毒和其他有毒物质引起的一种肾疾病[1]。细菌感染引起的急性肾损伤是家禽养殖业常见的疾病之一,以肾肿大和肾功能障碍为主要特征,严重威胁着家禽养殖业的发展[2]。禽病原性大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)是引起细菌性感染性疾病的重要病原菌,各日龄段的鸡都可能被大肠杆菌感染,其中以1个月内的雏鸡更易感[3]。抗生素是目前治疗细菌性疾病的主要药物,然而,抗生素的滥用易使细菌产生耐药性,加之我国养殖行业减抗、限抗、替抗政策的实施,寻找新的天然产物来替代抗生素的工作显得更加迫切。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大肠杆菌细胞壁的重要组成成分,当细菌死亡时释放大量LPS并可引起肾急性损伤[4]。研究表明,LPS可以激活小鼠心肌细胞凋亡和抑制自噬,从而引起心功能障碍[5]。细胞凋亡是机体组织进行自我更新的一种程序性死亡方式,但过度的细胞凋亡是疾病发生的基础,LPS引起AKI和细胞凋亡有密切关系[6-7]。自噬是细胞维持稳态的一种方式,细胞通过自噬溶酶体途径降解受损细胞器[8-9]。自噬和凋亡往往相伴出现,相互影响并参与调控疾病的发生发展[10]。

积雪草酸(Asiatic acid,AA)具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等生物活性功能[11-13],在许多疾病的预防和治疗中受到广泛关注。研究发现,AA能够通过减少视网膜细胞凋亡预防青光眼[14];AA还可通过减少内质网应激和触发自噬改善急性肝损伤[15]。然而,AA对LPS引起肉鸡AKI中细胞凋亡和自噬的影响尚未见报道。因此,本研究拟通过肉鸡腹腔注射LPS构建AKI模型,旨在探讨AA对LPS诱导肉鸡AKI的预防效果并从细胞凋亡和自噬角度来阐明其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验设计

从新兴大华农公司购买40只1日龄健康雄性黄羽肉仔鸡(SCXK 2018-0019),经适应性饲养至7日龄时,随机分为4组,即空白对照组(Con)、LPS诱导的肾损伤模型组(LPS)、AA低剂量组(LPS+AA 15 mg·kg-1)和AA高剂量组(LPS+AA 30 mg·kg-1)。基于前期的研究成果[16],本研究选择了15和30 mg·kg-1剂量的AA进行动物试验。AA悬浮于羧甲基纤维素钠悬浮液中,AA处理组的肉鸡从7日龄开始,每日用相应剂量的AA灌胃14 d,LPS组和AA处理组的肉鸡在第16、18和20日龄时腹腔注射0.5 mg·kg-1LPS构建急性肾损伤模型,Con组注射相应剂量的生理盐水,在第20日龄腹腔注射LPS 12 h后处死肉鸡并采集肾组织样品,Con组和LPS组肉鸡灌胃相等剂量的羧甲基纤维素钠悬浮液。本次动物试验经华南农业大学动物使用伦理委员会批准(2021b112)。

1.2 试验试剂与仪器

脂多糖(E.coli055:B5 L2880)、多聚甲醛固定液购自美国Sigma公司;积雪草酸(98%)购自上海阿拉丁有限公司;羧甲基纤维素钠购自北京索莱宝;组织包埋块、电泳液粉末和转膜液粉末购自武汉塞维尔有限公司;RNA逆转录试剂盒(R312-01)、qPCR荧光染料Master Mix (Q711-02)购自南京诺唯赞有限公司;TRIzol裂解液购自日本TaKaRa;MDA、GSH-Px、SOD、CAT检测试剂盒,RIPA裂解液和PMSF抑制剂购自上海碧云天;辣根过氧化物酶标记二抗购自康为世纪生物公司;Beclin1、ATG5、LC3、P62抗体购自武汉三鹰生物有限公司;BAX、Bak1、BCl2抗体由上海Abmart提供;P53、Cleaved-Caspase3/Caspase3抗体购自沈阳万类生物公司;GAPDH抗体购自南京巴傲得生物公司。

酶标仪(Elx808)购自美国Bioteck公司;微量紫外分光光度计(Nanodrop-2000)购自美国Thermo Fisher;基因扩增仪(MyCycler Thermal)购自美国Bio-Rad公司;荧光定量PCR仪(LightCycler480)购自美国Roche公司;光学显微镜(DM1000)、正置荧光显微镜(DMi8)、组织切片机(RM2235)购自德国Leica;低温高速离心机(D3024R)购自美国SCILOGEX公司;SDS-PAGE 蛋白电泳仪(BG-power 600)购自上海天能公司。

1.3 组织病理学染色

肾组织包埋由武汉塞维尔提供服务,使用切片机将组织包埋块切成4 μm的薄片并黏附在病理级载玻片上,37 ℃烘烤过夜。随后55 ℃融蜡1 h,经透明、梯度酒精脱水后进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin, HE)染色,随后在光学显微镜下观察肾组织的病理变化。

1.4 肾组织中氧化-抗氧化指标的测定

肾组织在匀浆液中匀浆,12 500×g条件下离心10 min后取上清液,经BCA试剂盒测定蛋白浓度;检测步骤根据碧云天氧化应激试剂盒说明书严格进行操作,采集数据后进行统计分析。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

称取20 mg肾组织放入含有500 μL TRIzol裂解液的EP管中,手动匀浆后12 500×g离心10 min,并按照TRIzol试剂盒的步骤提取肾组织总RNA;将提取后的RNA在微量紫外分光光度计测定浓度和纯度,并稀释至500 ng·μL-1;按照RNA逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA,稀释10倍后用于后续试验。从NCBI获取引物序列,引物序列由广州擎科生物公司合成;引物序列见表1,以GAPDH作为管家基因。按照cDNA 2 μL,上、下游引物各0.8 μL,DEPC水6.4 μL和荧光染料Master Mix 10 μL的体系混合后经过实时荧光定量PCR仪检测其基因表达水平;qRT-PCR的反应条件为预变性95 ℃ 30 s;95 ℃反应10 s,60 ℃反应30 s,反应循环40次,得到熔解曲线并计算其Ct值,随后分析肾中细胞凋亡和自噬相关基因的表达水平。

表1 qRT-PCR检测中使用的引物序列

1.6 蛋白免疫印迹

称取20 mg肾组织至2 mL EP管中,并加入250 μL RIPA蛋白裂解液,手动匀浆后静置10 min以充分裂解组织蛋白,随后12 500×g条件下离心10 min;取上清并用BCA试剂盒将蛋白定量至1.25 μg·μL-1,稀释后的样品、Lodding buffer体积比按照4∶1进行混合后在100 ℃下沸腾10 min,结束后分装储存。将制备好的总蛋白样品通过12.5%的SDS-PAGE凝胶分离后,经过转膜步骤转移至PVDF膜上;5%脱脂奶粉封闭1 h,经PBS清洗3次后与Bak1、BAX、BCl2、Cleaved-Caspase3/Caspase3、P62、Beclin1、ATG5和LC3抗体在4 ℃条件下孵育16 h;PBS清洗3遍后使用HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗孵育1 h,在全自动化学发光系统检测蛋白条带的表达。

1.7 免疫组织化学技术检测Cytc蛋白的表达与分布

肾组织包埋块经切片机制成4 μm的薄片,黏附在防脱病理级切片,37 ℃烤片过夜后备用。55 ℃烤片1 h,经二甲苯透明和梯度酒精脱水等步骤后,在加热至即将沸腾的10 mmol·L-1的柠檬酸钠溶液(pH=6.0)反应10 min进行抗原修复操作。随后使用85%的甲醇配制3%的H2O2溶液阻断肾组织中的内源性过氧化物酶;经过3次PBS清洗后,使用10%的马血清在37 ℃条件下封闭1 h,封闭结束后使用Cytc抗体在4 ℃条件下孵育组织切片18 h;使用辣根过氧化物酶标记二抗在室温条件下孵育1 h,并在DAB显示液作用下显色。在光学显微镜下观察肾组织中Cytc蛋白的表达与分布并采集相片,ImageJ分析上述结果的光密度值。

1.8 免疫荧光技术检测LC3-II蛋白的表达与分布

肾组织切片的制备同“1.7”,肾组织切片在55 ℃条件下烤片1 h,经二甲苯透明和梯度酒精脱水后,使用1%的Triton溶液进行细胞膜穿孔15 min,随后使用马血清在37 ℃条件下封闭肾组织1 h以去除非特异性蛋白的影响,经PBS清洗3遍后使用LC3-II抗体在4 ℃条件下孵育肾组织18 h;PBS清洗3次后使用Cy3标记二抗在室温下孵育肾组织切片1 h后DAPI染细胞核进行定位。抗荧光淬灭剂滴加在组织上后即可封片,并在正置荧光显微镜下观察并采集照片以用于后续分析。

1.9 TUNEL染色检测细胞凋亡率

肾组织切片在55 ℃条件下烤片1 h,新鲜二甲苯透明和梯度酒精脱水后使用蛋白酶K孵育30 min,经PBS清洗3遍后,使用PBS配制3%的H2O2溶液,组织切片在室温条件下浸泡20 min以灭活组织内源性过氧化物酶,随后按照说明书步骤配制Streptavidin-HRP工作液,每个组织滴加50 μL工作液并孵育30 min,再次用PBS清洗3遍后使用DAB显色液显色,显色结束后用苏木精染细胞核以进行定位,梯度酒精脱水和新鲜二甲苯透明后使用中性树脂封片,光学显微镜下观察并采集图像,ImageJ进行分析。

1.10 数据处理

最终数据以“平均值±标准差(mean±SD)”表示,本研究所有试验数据均来源于至少3个独立试验,数据经Excel 2016简单后处理使用GraphPad Prism 9进行作图,组间采用单因素方差分析(one-way ANOVA)并进行Turkey检验;*表示与对照组相比较以及两组之间的比较,#表示与LPS组相比较;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AA减轻LPS诱导的肉鸡AKI

如图1所示,Con组肾细胞结构完整,无任何病理变化。LPS组肾小球扩张、剥落,还可见细胞肿胀,肾小球空泡变性和萎缩。AA预处理低剂量组和高剂量组都减轻了LPS引起的肉鸡肾的病变,且AA在30 mg·kg-1范围内呈现剂量依赖性。相比起对照组肉鸡肾脏系数,LPS引起肉鸡肾脏系数极显著增加(P<0.001),这是肾肿胀的表现;而AA低剂量和高剂量预处理肉鸡都能够显著地降低LPS诱导的肉鸡AKI中的肾脏系数(P<0.05)。

A. 肾组织病理学检查(400×);蓝色箭头:肾小管扩张和肾小管上皮细胞脱落;黑色箭头:肾小球空泡变性;红色箭头:肾小球萎缩;B. 肾脏系数:*表示与对照组相比较以及两组之间的比较,****P<0.001,#表示与LPS组相比较,##P<0.01,下同;C. 积雪草酸分子结构图A. Histopathology of kidney (400×); Blue arrow: Dilation of renal tubules and detachment of renal tubular epithelial cells; Black arrow: Glomerular vacuolar degeneration; Red arrow: Glomerular atrophy; B. Kidney coefficient: * is expressed comparison with the control group and between the two groups,****P<0.001, # is expressed comparison with the LPS group, ##P<0.01, the same as below; C. Molecular structure of Asiatic acid

2.2 AA对LPS诱导肉鸡AKI中氧化-抗氧化指标的影响

与Con组相比,LPS显著增加了肉鸡肾中的MDA水平(P<0.05),AA低剂量和高剂量都显著降低了LPS诱导肉鸡AKI的MDA水平且呈剂量依赖性(P<0.05)。与Con组相比,LPS均显著降低了肉鸡肾中的GSH-Px、CAT和SOD酶活性(P<0.05),而AA低剂量和高剂量预处理组肉鸡肾中CAT和SOD酶活性均显著升高(P<0.05),AA低剂量虽增加了GSH-Px的活性,但差异不显著(P>0.05),AA高剂量则显著增加了肉鸡肾中GSH-Px的活性(P<0.05),AA预处理效果呈剂量依赖性(表2)。

表2 AA对LPS诱导肉鸡AKI氧化-抗氧化指标的影响

2.3 AA对LPS诱导肉鸡AKI中细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响

如图2所示,与对照组相比,LPS显著增加了P53、BAX、Caspse3的mRNA水平(P<0.05),增加了Bak1和Cytc的mRNA水平(P>0.05),抑制了BCl2的mRNA水平(P>0.05)。AA预处理显著降低了LPS肉鸡肾中P53、BAX、Caspse3的mRNA水平,且呈剂量依赖性(P<0.05);AA降低了Bak1和Cytc的mRNA水平,但差异不显著(P>0.05)。AA剂量依赖性地增加了LPS肉鸡肾中BCl2的mRNA水平(P<0.05)。Western blot结果显示,LPS处理显著增加了P53、Bak1、BAX和Cleaved-Caspase3的蛋白表达(P<0.05),而抑制了BCl2蛋白的表达(P<0.05)。AA预处理呈剂量依赖性地降低了LPS肉鸡肾中P53、Bak1、BAX和Cleaved-Caspase3的蛋白表达(P<0.05),而升高了BCl2蛋白表达,但差异不显著(P>0.05)。

A～F. 细胞凋亡相关mRNA表达水平;G. Western bolt检测细胞凋亡相关蛋白表达;H～L. 细胞凋亡相关蛋白的表达;*表示与对照组相比较以及两组之间的比较(*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001),#表示与LPS组相比较(#P<0.05, ##P<0.01和###、####P<0.001);P<0.05表示差异有统计学意义。下同A-F. Apoptosis-related mRNA expression levels; G. Western blot detects relative protein expressions of apoptosis; H-L. Relative protein expressions of apoptosis;* is expressed comparison with the control group and between the two groups (*P<0.05,**P<0.01 and ***P<0.001); # is expressed comparison with the LPS group (#P<0.05, ##P<0.01 and ###, ####P<0.001); P<0.05 indicates a statistically significant difference. The same as below.

2.4 AA对LPS诱导肉鸡AKI中Cytc蛋白表达与分布和肾细胞凋亡率的影响

如图3A、3B所示,与Con组相比,LPS极显著地增加了肉鸡肾组织中Cytc蛋白的表达与分布(P<0.001),而AA预处理在30 mg·kg-1剂量内呈剂量依赖性的降低了LPS肉鸡肾组织中Cytc蛋白的表达与分布,且差异极显著(P<0.001)。为进一步证明AA对LPS诱导肉鸡肾细胞凋亡的保护作用,使用TUNEL染色检测肾细胞凋亡率。TUNEL染色结果如图3C、3D所示,与Con组肉鸡肾凋亡率相比,LPS极显著增加了肾细胞凋亡率(P<0.001),AA低剂量和AA高剂量预处理组都极显著地降低了LPS肉鸡肾细胞凋亡率(P<0.001),且呈剂量依赖性。

A、B. 免疫组化检测Cytc蛋白的表达与分布;黑色箭头:Cytc蛋白表达;C. TUNEL染色;黑色箭头:凋亡细胞D. 细胞凋亡率A, B. Immunohistochemistry detects the protein expression and distribution of Cytc; Black arrow: the protein expression of Cytc; C. TUNEL staining; Black arrow: apoptotic cell; D. Apoptosis rate

2.5 AA对LPS诱导肉鸡AKI中细胞自噬相关基因和蛋白表达的影响

如图4所示,与Con组相比,LPS处理升高了肉鸡肾组织中P62的mRNA水平(P>0.05),同时降低了ATG5(P>0.05)、Beclin1(P<0.05)、LC3-I(P>0.05)和LC3-II(P<0.05)的mRNA水平。AA预处理组肉鸡和LPS模型组肉鸡肾中P62的mRNA水平差异不显著,但呈下降趋势(P>0.05)。AA预处理还呈剂量依赖性地升高了ATG5、Beclin1、LC3-I和LC3-II的mRNA水平(P<0.05)。Western blot结果显示,LPS处理升高了肉鸡肾中P62的蛋白表达(P>0.05),而AA预处理降低了LPS诱导肉鸡AKI中P62的蛋白表达,差异不显著(P>0.05)。LPS显著降低了肉鸡肾中ATG5、Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白表达(P<0.05),而AA预处理显著地升高了LPS诱导肉鸡AKI中ATG5、Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白表达(P<0.05),且呈剂量依赖性。

A～E. 细胞自噬相关mRNA表达水平;F. Western blot检测细胞自噬相关蛋白;G～J. 细胞自噬相关蛋白表达A-E. Autophagy-related mRNA expression levels; F. Western blot detects relative protein expressions of autophagy; G-J. Relative protein expressions of autophagy

2.6 AA对LPS诱导肉鸡AKI中LC3-Ⅱ蛋白表达与分布的影响

如图5A、5B所示,与Con相比,LPS极显著降低了肉鸡肾组织中LC3-II的表达与分布(P<0.001)。而AA高剂量和低剂量都极显著地增加了LPS组肉鸡肾组织中LC3-II蛋白的表达与分布(P<0.001)。

A、B. 免疫荧光检测LC3-II蛋白的表达与分布A, B. Immunofluorescence detects the protein expression and distribution of LC3-II

3 讨 论

细菌感染引起的肉鸡AKI是家禽集约化养殖中较常见的疾病之一,它能导致肉鸡生长缓慢甚至死亡,给家禽养殖业造成严重的损失。抗生素是细菌感染性疾病的主要治疗药物,但长期使用抗生素会使细菌产生耐药性,还可引起家禽发生内毒素血症并导致家禽死亡。目前我国已实施减抗、限抗、替抗政策,加之中国中草药资源丰富,天然产物在家禽养殖中的作用受到越来越多的关注[17-18]。AA是从积雪草中提取的五环三萜皂苷,已被证明具有抗炎、抗凋亡和抗肿瘤等生物活性[19]。本团队之前的研究表明,60 mg·kg-1剂量的AA处理肉鸡未见明显毒性,且30 mg·kg-1剂量的AA能更有效地减轻LPS诱导的肝损伤和肾损伤[9,16]。因此,本试验选择了15和30 mg·kg-1剂量的AA进行研究。结果表明,AA通过抑制氧化应激和细胞凋亡以及促进细胞自噬减轻LPS诱导的肉鸡AKI, 这一结论进一步证明了AA在LPS诱导肉鸡AKI中的保护作用。

LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分,伴随着细菌的死亡释放至血液中并作用于肾等器官。LPS常用于诱导炎性因子释放和建立AKI模型。LPS诱导AKI的机理是其与Toll样受体4(TLR4)结合并激活炎症反应和氧化应激[20]。尽管LPS诱导AKI的致病机理已初步阐明,但其具体发病机制和治疗策略仍有待进一步研究。研究表明,LPS可引起肾严重的病理损伤,包括肾小管扩张、肾小管上皮细胞脱落和肾小球萎缩等病理变化[21]。本研究通过给肉仔鸡腹腔注射0.5 mg·kg-1剂量的LPS成功建立AKI模型,结果发现LPS会引起肉鸡肾小管扩增、肾小管上皮细胞脱落,肾小球萎缩和肾小球空泡样病变,前期试验结果也支持了这一点[16]。AA预处理减轻了LPS诱导肉鸡肾的病理损伤,这和前人的研究结果是一致的[22]。此外,LPS处理显著增加了肉鸡的肾脏系数,表明LPS会引起肉鸡肾肿胀,这和之前的研究发现是一致的[23];而AA预处理14 d后可以显著降低LPS诱导肉鸡AKI的肾脏系数,这表明AA可以缓解LPS引起的肉鸡肾肿胀。LPS不仅可以刺激炎症因子的释放同时会诱导过量ROS的产生并激活氧化应激,引起细胞抗氧化酶活性下降和脂质过氧化物MDA水平增加[24-25];研究结果显示,LPS处理显著增加肉鸡肾组织中MDA水平以及显著降低GSH-Px、SOD和CAT酶的活性,这和前人的研究结果是相符合的[26]。有趣的是,AA预处理可以显著降低LPS肉鸡肾组织的MDA水平,同时升高GSH-Px、SOD和CAT的酶活性。总之,上述结果表明,AA能够抑制LPS引起肉鸡肾组织的氧化应激,从而减轻LPS诱导肉鸡AKI。

凋亡是细胞自我更新的程序性死亡方式,而过度的细胞凋亡是组织损伤的表现;氧化应激会引起线粒体通透性增加并导致Cytc从线粒体转运到细胞质中,随后激活Caspase3并触发线粒体途径的细胞凋亡[27]。细胞凋亡的特征还包括促凋亡蛋白P53、BAX和Bak1的表达增加,抗凋亡蛋白的表达减少[28]。先前的研究表明,LPS诱导的器官损伤和细胞凋亡有着密切联系,LPS可激活过度的炎性反应和氧化应激,进而介导细胞凋亡[29]。本研究发现,LPS处理增加肉鸡肾中P53、BAX、Bak1、Cytc和Caspase3的mRNA表达水平,降低BCl2的mRNA水平;同时,LPS处理增加了肉鸡肾中P53、BAX、Bak1和Cleaved-Caspase3的蛋白表达以及降低BCl2蛋白的表达;此外,免疫组织化学的结果显示,LPS处理显著增加Cytc在肾组织中的表达;TUNEL结果发现,LPS极显著地增加肾组织中的细胞凋亡率,这和前人的研究结果是一致的[30]。有意思的是,AA预处理可显著降低P53、BAX、Bak1、Cytc和Caspase3的基因和蛋白表达,上调BCl2基因和蛋白的表达;AA还能降低Cytc蛋白在LPS诱导肉鸡AKI中的表达,且极显著抑制LPS诱导肉鸡肾组织的细胞凋亡率。上述结果首次表明,AA预处理通过调控细胞凋亡相关基因和蛋白表达水平减轻了LPS诱导的肉鸡AKI。

自噬是溶酶体降解受损的细胞器并进行自我更新的过程,在维持细胞稳态方面具有重要作用[31]。P62 是具有多结构的蛋白,在细胞信号转导、增殖和炎症中起着关键作用[32];Beclin1是调节自噬活性的关键因子,当Beclin1表达减弱时表明自噬被抑制[33-34]。ATG5和LC3是自噬的重要标志物,抑制自噬会导致ATG5和LC3蛋白的表达降低[35-36]。研究表明,LPS可引起过度自噬诱导细胞损伤[37];然而,也有研究证明LPS处理可以抑制细胞自噬,导致细胞功能障碍并诱导器官损伤[38]。本研究发现,LPS处理降低了肉鸡肾组织自噬相关基因和蛋白的表达水平,而AA预处理显著增加LPS诱导的肉鸡AKI中自噬相关基因和蛋白的表达水平;此外,免疫荧光结果显示,AA预处理极显著地增加了LPS诱导的肉鸡AKI中LC3-II蛋白的表达。本研究首次表明AA预处理能通过促进自噬减轻LPS诱导肉鸡的AKI。

4 结 论

总之,积雪草酸(AA)通过降低肾氧化应激水平、减少细胞凋亡和促进细胞自噬减轻LPS诱导的肉鸡急性肾损伤(AKI),这为AA成为潜在的家禽饲料添加剂提供了有力的理论依据。