羊肚菌液体发酵提取物对烟叶品质的影响

王 娟，游金坤，邓雅元，孙达锋，杨璐敏， 华 蓉

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221；2.云南省食用菌产业发展研究院，云南昆明 650221）

烤烟经过采收、初烤和打叶复烤后，烟叶的品质仍然有不足，还需要经过较长时间的醇化过程使烟气变得醇和、圆润，满足卷烟加工的要求[1-2]。在后续的卷烟生产过程中为了使卷烟配方配伍性更好，品牌辨识度更强，加香加料更是一个不可或缺的环节[3-4]。羊肚菌（Morchella esculenta）属偏低温喜湿型真菌，具有代谢木质素、纤维素的能力[5-6]，而纤维素、半纤维素和木质素是烟草细胞壁的主要成分，不仅影响烟叶的加工性能和内在品质；同时，这些成分受热裂解时，还会释放低级醛类、酚类、苯并芘等有害成分[7-9]。李仙等人[10]利用羊肚菌菌丝体为出发菌株，采用固体渥堆发酵技术获得了羊肚菌发酵粗多糖并应用于卷烟中，结果表明添加至卷烟及初烤烟后具有醇和烟香、提高舒适性、去除杂气的效果。这为羊肚菌类型的大型真菌在卷烟中的应用探明了前景，未见羊肚菌菌丝体在卷烟中应用的其他报道。因此，通过加料的方式将羊肚菌菌株液体发酵提取物应用于烤烟的品质提升中，可极大丰富大型真菌的工业应用，同时形成具有卷烟应用前途的天然菌类香料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

羊肚菌（Morchella esculenta（L.）Pers.）菌株编号：Y34#，供试菌株试管菌种收集于野外采集羊肚菌，保存于中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所。

1.1.2 材料、试剂和仪器

供试烟叶：2021 年云南普洱初烤烟叶，（等级B3F、C3F、X2F），云南瑞升烟草技术（集团）有限公司提供；培养基：玉米粉2.5%，酵母膏2%，MgSO40.05%，KH2PO40.1%，（NH4）2SO40.5%，pH 值自然。

试剂：乙醇，盐酸，无水硫酸钠，二氯甲烷，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

仪器：100L 型液体发酵罐，镇江东方生工有限责任公司产品；SHZ-1 型循环水式真空泵，巩义市英峪豫华仪器厂产品；BUCHIR-3000 型旋转蒸发仪，瑞士BUCHI 公司产品；HP6890/5972 型气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司产品；701-4 型电热干燥箱，上海跃进医疗器械厂产品；恒温培养摇床，哈尔滨市东明医疗仪器厂产品；恒温培养箱，湖北黄石市医疗器械厂产品；立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司产品；FL820 型超净工作台，昆明金京田科贸有限责任公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 羊肚菌菌丝体的收集

采用液体发酵罐（25 L）发酵，条件如下：通气量1∶1（V/V·min），搅拌转速120 r/min，pH 值4，温度22 ℃，接种量15%，罐压0.16 MPa。发酵72 h 后过滤收集菌丝球，无菌水洗涤3 次，于60 ℃下烘干至恒质量，称量菌丝体干质量。

1.2.2 提取方法

取适量羊肚菌菌丝体于圆底烧瓶中，以原料质量5 倍的80%乙醇热回流提取2 h，过滤，收集滤液为提取液A；残渣继续以原料质量8 倍的水热回流提取3 h，同样过滤收集提取液B，残渣弃之。将提取液B 浓缩成相对密度为1.275±0.007 的浓缩膏，并以提取液A 回溶，充分搅拌后于-15 ℃条件下冷冻24 h，冷冻液抽滤处理，滤液继续浓缩成相对密度1.373±0.007 浓缩膏，即得羊肚菌液体发酵提取物。

1.2.3 羊肚菌液体发酵提取物在烟叶中的加料试验

按不同用量分别添加到所选择的普洱系列烟叶烟丝上，将烟丝置于封袋中室温下放置2 h 后卷制成烟支，同时将未添加醇化剂的烟丝制成对照烟支，放入温度（22±1）℃，相对湿度（60±2）%的恒温恒湿箱内平衡48 h，按《卷烟第4 部分：感官技术要求》（GB 5606.4—2005）[11]规定的方法进行评吸。

（1）烟叶常规化学成分：总氮依据YC/T 161—2002 检测，烟碱依据YC/T 246—2008 测定，总糖和还原糖依据YC/T 159—2002 检测，水分依据GB/T 23357—2009 测定，pH 值依据YC/T 222—2007 测定，氯依据YC/T 162—2011 检测，石油醚提取物依据YC/T 176—2003 检测，总挥发碱依据YC/T 35—1996 检测。

（2）卷烟主流烟气成分中粒相物测定样品前处理及分析：卷烟样品于温度（22±2）℃和相对湿度（60±5）%的条件下平衡48 h 后，采用标准抽吸条件（根据国家标准GB/T 19609—2004[12]的要求对卷烟主流烟气中粒相物进行补集）用剑桥滤片捕集主流烟气中的粒相物，抽吸完成后，将剑桥滤片置于50 mL 锥形瓶中，加入10 mL 丙酮，超声萃取30 min，并加入40 μL 内标定容至1 mL 进行GC/MS 分析。分析条件：进样口温度240 ℃，载气为He，流速1 mL/min，GC-MS接口温度250 ℃，升温梯度为50 ℃（2 min）→3 ℃/min →160 ℃（1 min）→4 ℃/min →280 ℃（20 min），离子源为EI 源，电子能量70 eV，扫描范围35～455 amu。

（3）羊肚菌液体发酵提取物的GC-MS 成分分析：称取样品25 g，蒸馏水稀释至250 g，放入同时蒸馏萃取装置一端的500 mL 圆底烧瓶中，用电热套加热；装置的另一端为盛有25 mL 二氯甲烷的100 mL圆底烧瓶，于60 ℃条件下水浴加热，同时蒸馏萃取3 h。二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，于4 ℃过夜，过滤，滤液倒入浓缩瓶中用Vigreux 柱浓缩至约1 mL，浓缩液用于GC-MS 分析。分析条件：色谱柱：HP-5MS 型（60 m×0.132 mm×0.125 μm)；载气为氦气，纯度为99.999%，流速1 mL/min；进样口温度240 ℃；分流比10∶1；MSD 传输线温度280 ℃；MS 四极杆温度150 ℃；离子源温度250℃；扫描范围35～450 amu；离子源为EI，电子轰击能量70 eV；升温程序：50 ℃为起始温度（保留1 min），以3 ℃/min 升到180 ℃，再以15 ℃/min 升到250 ℃（保留3 min）。

所得图谱经计算机谱库（NIST98）检索，并用内标校正归一化法计算各峰的相对含量。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌液体发酵提取物的挥发性成分分析

利用GC/MS 对羊肚菌液体发酵提取物进行挥发性成分分析。

羊肚菌液体发酵提取物总离子流图见图1，羊肚菌液体发酵提取物的挥发性成分分析结果见表1。

表1 羊肚菌液体发酵提取物的挥发性成分分析结果

图1 羊肚菌液体发酵提取物总离子流图

羊肚菌液体发酵提取物的挥发性成分中酸类成分占比33.86%，为其主要成分，有机酸能够增加烟气的酸性，提高烟气浓度并使烟气醇和、甜润舒适[13-14]。挥发性成分中苯乙醇（7.61%）、2-5 氢呋喃酮（5.34%）、呋喃-3 -甲醇（3.99%）、亚油酸乙酯（3.74%）、邻苯二甲酸二丁酯（3.53%）、糠醛（2.78%）、3 -羟基-2 -丁酮（2.21%）、邻苯二甲酸二异丁酯（2.11%）均是重要的烟草香气前体物和香气成分，直接影响烤烟的香气风格、香气品质和香气量[15-16]，为该提取物应用于烤烟加料环节、提升烟叶品质奠定了物质基础。

2.2 羊肚菌液体发酵提取物加料效果的评定

羊肚菌液体发酵提取物在烟叶加料中的用量试验方案见表2。

表2 羊肚菌液体发酵提取物在烟叶加料中的用量试验方案

评吸结果显示，添加羊肚菌液体发酵提取物处理后的烟叶整体品质有明显提高，整体刺激小，香气质好，杂气降低，香气柔绵性较好。其中，上部烟在烟香醇和性、掩盖杂气方面效果较明显；下部烟在掩盖杂气方面效果较好；中部烟在增加烟香醇和性方面有效果。

2.3 羊肚菌液体发酵提取物最大用量的确定

羊肚菌液体发酵提取物最大用量对比试验方案见表3。

表3 羊肚菌液体发酵提取物最大用量对比试验方案

评吸结果显示，添加0.1%羊肚菌液体发酵提取物处理的样品在掩盖杂气、改善烟气品质、协调烟气方面效果较好，而添加量为0.2%的烟叶处理样品在醇和烟香、降低刺激方面效果较好，综合评吸结果为0.1%＞0.2%＞0.05%＞对照。

2.4 羊肚菌液体发酵提取物处理样常规化学成分分析

羊肚菌液体发酵提取物处理样与对照常规化学成分分析见表4。

表4 羊肚菌液体发酵提取物处理样与对照常规化学成分分析

由表4 可知，经过羊肚菌液体发酵提取物处理后的烟叶样品与对照相比，在总氮、烟碱、总挥发碱含量上均较对照降低，总糖和还原糖则有所提高，也是抽吸品质表现为醇和的内在化学成分的体现[17]。

2.5 羊肚菌液体发酵提取物处理样烟气成分分析

羊肚菌液体发酵提取物处理样与对照烟气成分分析见表5，羊肚菌液体发酵提取物处理样与对照烟气成分分类见表6。/ μg·支-1

表5 羊肚菌液体发酵提取物处理样与对照烟气成分分析 /μg·支-1

表6 羊肚菌液体发酵提取物处理样与对照烟气成分分类 /μg·支-1

卷烟的独特消费模式是以烟气吸食形式体现的，其烟气成分直接反映了烟叶香吃味质量，是烟叶品质的内在物质基础。从烟气分析结果来看，羊肚菌液体发酵提取物处理样与对照相比在吡啶型生物碱（主要为烟碱）、酸类、醇类、酮类、酯类、酚类的总量上均有降低（平均降低率约30%），使得该处理样在评吸上较对照表现为协调烟气，降低刺激性、降低劲头的作用。

3 结论

加料、酶解等生物醇化技术在烟叶中的应用主要是促进烟叶大分子化合物的降解、转化及小分子香气物质的合成、积累，进而引起卷烟烟气成分及感官品质的变化[18-20]。结合挥发性成分分析、用量试验、常规化学成分分析、烟气成分分析及感官评吸表明，烟叶中加入不同浓度羊肚菌液体发酵提取物，对烟叶品质有明显提高，在提升香气品质、协调烟气、降低杂气和刺激性、降低劲头、加速烟叶醇化方面效果明显，且用量较低，可适用于卷烟加料、初烤烟的醇化及烟草薄片涂布料的使用中，符合卷烟的“降焦减害”生产要求。不同用量处理出的烟叶效果上有差异，需要针对上、中、下部位的烟叶做用量试验优化研究，最终挑选出效果较优的用量。