宣恩火腿加工过程中脂肪组成及脂肪酶和磷脂酶活力变化研究

范 露，李婵娟，邱朝坤

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉 430205）

采用盐腌手段和发酵技术保存食物是人类重要的发明，干腌火腿集2 种技术于一身，既可以长期保存肉，也得到了美味的肉制品，深受国内外消费者的欢迎[1-2]。火腿的风味主要来源于其漫长的加工周期内，脂肪和蛋白质在酶的作用下发生的水解和氧化等一系列反应[3-4]，其中脂质的氧化是最重要的形成途径[5]。

动物体内的脂肪主要以甘油酯（中性脂）和磷脂两种形式存在，其水解和氧化是脂类物质形成风味成分的基础[6]。火腿在加工过程中，脂肪在内源酶的作用下产生游离脂肪酸[7]，并进一步氧化形成风味物质，游离脂肪酸的氧化比甘油酯和磷脂更加容易发生[8]。因此，脂肪的水解对火腿风味的形成发挥着重要作用。研究表明，组织中影响脂类物质水解的酶类主要是脂肪酶和磷脂酶[9]，由于宣恩火腿加工过程中pH 值变化范围为5.91～6.75[10]，因此主要研究宣恩火腿加工过程中酸性脂肪酶、中性脂肪酶和磷脂酶活力的变化。以期掌握宣恩火腿加工过程中脂肪的变化规律，可为火腿风味形成机理研究提供支撑，进而为宣恩火腿的工业化生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究5 个阶段的样品分别为原料腿（新鲜腿）、腌制期（腌制1 个月）、发酵初期（发酵1 个月）、发酵中期（发酵4 个月）和成品腿。肌内脂肪指从股二头肌中提取的脂肪，皮下脂肪指从皮下1 cm 提取的脂肪。

4 -甲基伞形酮油酸酯（≥95%，HPCE）、4 -甲基伞形酮（＞98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；Amberlyst A-26 型阴离子交换树脂，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司提供；其余试剂为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C 型气质联用仪，Agilent 公司产品；RF-6000 型荧光分光光度计，Shimadzu 公司产品；T18 型分散机，IKA 公司产品；RE-52A 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；DF-101S 型磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限公司产品；Neofuge 18R 型高速冷冻离心机，Heal Force 公司产品；AL-104 型分析天平、FE20 pH 计，Metteler toledo 公司产品；UV2000 型紫外分光光度计，Unico公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 脂肪提取

采用氯仿-甲醇溶液提取脂肪，具体试验步骤参照文献[11]。

1.3.2 脂肪的分离

称取40 g 经活化的硅胶（G-100），加入氯仿制成悬浮液，装入层析柱中。称取1 g 脂肪用少量氯仿溶解后上柱，依次用氯仿、甲醇洗脱，收集氯仿洗脱液即为甘油酯（含游离脂肪酸），收集甲醇洗脱液即为磷脂，将洗脱液于40 ℃条件下真空浓缩至干，分别得到甘油酯（含游离脂肪酸）和磷脂，用A-26型阴离子交换树脂将甘油酯（含游离脂肪酸）分离为甘油酯和游离脂肪酸[12]。

1.3.3 脂肪酸组成分析

脂肪酸组成采用内标法测定，具体试验步骤参照GB 5009.168—2016[13]。

1.3.4 酶液提取与酶活测定

取5 g 股二头肌样品，加入25 mL pH 值7.5 含5 mmol/L EGTA 的磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L）。在冰水浴中用均质机以转速25 000 r/min 处理30 s，然后在冰水浴中用磁力搅拌器以转速200 r/min 搅拌30 min，再在4 ℃条件下以转速12 000 r/min 离心20 min，上清液即为粗酶液。粗酶液蛋白质含量用双缩脲法进行测定。

酸性脂肪酶活性测定：取0.2 mL 粗酶液，加入2.7 mL pH 值5.0 含0.05%（W/V）Triton X-100 和0.8 mg/mL 牛血清白蛋白的磷酸二氢钠（0.1 mol/L）-柠檬酸（0.05 mol/L）缓冲液，再加入0.1 mL 4 -甲基伞形酮油酸酯（1 mmol/L）作为底物，将试管置于37 ℃水浴锅中保温反应45 min，然后加入0.5 mL HCl 溶液（1 mol/L）终止反应，用荧光分光光度计测定荧光强度，激发波长328 nm，发射波长470 nm。中性脂肪酶活性测定步骤同酸性脂肪酶，但需将缓冲液pH 值调整至7.5，且不用添加牛血清蛋白，发射波长调整为443 nm。磷脂酶活性测定步骤同酸性脂肪酶，但需在缓冲液中加入0.15 mol/L 氟化钠。分别用各自缓冲液配制系列浓度的4 -甲基伞形酮溶液作标准曲线，1 g 酶蛋白在1 h 内产生1 nmol 的4 -甲基伞形酮为一个酶活力单位（U/h·g）[14]。

2 结果与分析

2.1 宣恩火腿脂肪组成变化

火腿脂肪主要由甘油酯、磷脂和游离脂肪酸组成，三者含量的变化在火腿加工过程中是动态的，掌握其在不同阶段的变化趋势，有助于了解脂肪氧化和水解反应的剧烈程度。

不同阶段肌内脂肪和皮下脂肪组成见表1。

表1 不同阶段肌内脂肪和皮下脂肪组成 / %

由表1 可知，随着加工过程的进行，对于肌内脂肪而言，脂肪组成发生了较为明显变化，甘油酯比重增加了11.7%，磷脂比重降低了51.6%，游离脂肪酸比重增加了2.6 倍。皮下脂肪甘油酯比重相对稳定，而磷脂比重降低了53.1%，游离脂肪酸比重增加了2.5 倍。肌内脂肪游离脂肪酸含量明显高于皮下脂肪，表明肌内脂肪的水解反应更活跃，同时也表明肌肉为火腿的风味贡献比皮下脂肪多。

在宣恩火腿整个加工阶段，磷脂和游离脂肪酸的变化比较明显，表明甘油酯的降解速度比磷脂的降解速度慢。游离脂肪酸主要来源于甘油酯和磷脂的水解，其含量的迅速上升，为火腿风味的形成提供了重要反应前体物质。

2.2 宣恩火腿游离脂肪酸组成变化

火腿在漫长的加工周期内，脂类发生着水解、氧化及氧化产物与其他组分进一步反应等，游离脂肪酸是这些反应的产物或中间物质[15]。因此，对火腿游离脂肪酸的脂肪酸组成进行分析，有助于研究火腿风味形成过程和机理。

不同阶段肌内脂肪和皮下脂肪游离脂肪酸的变化见表2。

表2 不同阶段肌内脂肪和皮下脂肪游离脂肪酸的变化 / mg·g-1

由表2 可知，饱和脂肪酸（SFA）和单不饱和脂肪酸（MUFA）随着加工进行，含量均呈上升趋势，多不饱和脂肪酸（PUFA）则呈现出先上升后下降的趋势，表明宣恩火腿加工过程中，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的生成速度大于降解速度，而多不饱和脂肪酸在发酵中期开始其生成速度小于降解速度，产生这种结果的主要原因是多不饱和脂肪酸比单不饱和脂肪酸更加容易氧化分解。脂肪的氧化是火腿风味形成的主要渠道之一，表明从发酵中期开始，风味物质开始大量生成。

整体而言，肌内脂肪游离脂肪酸总量高于皮下脂肪，表明肌内脂肪磷脂和甘油酯的水解程度更剧烈，也表明火腿风味成分主要来源于肌肉。对于肌内脂肪而言，其不饱和脂肪酸在发酵初期含量上升幅度较大，单不饱和脂肪酸是腌制期的2.47 倍，多不饱和脂肪酸是腌制期的2.76 倍。不饱和脂肪酸的氧化既可以产生风味成分，也可以为其他呈味反应提供前体物质，因而进一步表明从发酵初期开始，风味成分开始大量生成。

2.3 宣恩火腿脂肪酶和磷脂酶活力变化

火腿加工过程中，脂肪的水解与氧化主要受酶的控制，化学作用较小[16]。这些酶的活性高低直接影响着脂肪的水解程度，从而进一步影响其风味成分的产生。

不同阶段脂肪酶和磷脂酶活力变化见表3。

表3 不同阶段脂肪酶和磷脂酶活力变化 / U（/h·g）-1

由表3 可知，从原料腿到成品，酸性脂肪酶、中性脂肪酶和磷脂酶活力均呈现较大下降趋势，酸性脂肪酶活性从4.30 U/h·g 下降到0.32 U/h·g，中性脂肪酶活性从9.81 U/h·g 下降到0.67 U/h·g，磷脂酶活性从6.31 U/h·g 下降到0.35 U/h·g。在火腿的不同加工阶段，酶活下降程度也不同，中性脂肪酶和磷脂酶在从腌制期到发酵初期活性降幅最大，酸性脂肪酶在从原料腿到腌制期活性降幅较大，随后酶活降幅趋于平缓。成品火腿中脂肪酶和磷脂酶活性处于较低水平，比崔莹莹[17]测定的宣恩火腿酶活低，但比陆瑞琪等人[16]测定的金华火腿酶活高。

酶活下降受多重因素影响，在腌制期间火腿盐含量迅速上升，细胞质渗透压增加，可能导致部分酶变性，活性受损。腌制结束后火腿会经历烘腿（温度50 ℃左右，时间7～8 d）工艺，在此条件下也可能导致部分酶活受损。发酵期内，火腿pH 值逐步降低，也可能导致磷脂酶和中性脂肪酶活性下降。

3 结论

通过对宣恩火腿不同加工阶段肌内脂肪和皮下脂肪构成测定，并对肌内和皮下脂肪游离脂肪酸组成进行了分析。结果表明，宣恩火腿加工过程中，肌内脂肪和皮下脂肪发生了较大的变化，甘油酯和磷脂水解生成了游离脂肪酸，游离脂肪酸中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪含量上升迅速，多不饱和含量增加程度相对较低，肌内脂肪对火腿风味前体物质的贡献大于皮下脂肪。

对不同加工阶段宣恩火腿脂肪酶和磷脂酶活性进行了测定，结果表明随着加工的进行，脂肪酶和磷脂酶活性不断减弱，尤其是从腌制期到发酵初期降幅较为明显。脂肪酶和磷脂酶活性的高低对火腿风味有重要影响，活性过高，脂肪过度水解，导致产生大量游离脂肪酸，从而进一步氧化导致火腿品质降低。酶活过低，脂肪水解偏低，能够反应形成风味物质的底物又不足，火腿风味无法形成。通过研究，掌握了宣恩火腿加工过程中，不同阶段脂肪酶和磷脂酶活性变化规律，可为宣恩火腿的标准化生产提供理论参考。