植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌微胶囊酸奶的研制

陈 娟，于 斌，郭宗明，王懿千，吕常旭*

（1.烟台南山学院 健康学院，山东 烟台 265713；2.四川旅游学院 烹饪科学四川省高等学校重点实验室，四川 成都 610100）

酸奶是牛奶经乳酸菌发酵而成，起源于保加利亚[1]。酸奶是目前国内外市场上公认的可将乳酸菌携带进入肠道的主要载体之一，但乳酸菌对消化道内各个阶段复杂的苛刻生理、生化环境耐受性比较差，其活性到达肠道后显著降低，难以发挥调节肠道微生态的功能，利用微胶囊技术将乳酸菌包埋保护起来再添加到酸奶中是提高酸奶益生功能性的重要途径之一[2-4]。微胶囊技术是将性能不稳定的固体、液体、气体包裹在由天然或者合成的高分子材料形成的半透性或全密封的微型胶囊的技术[5]。马秀霞[6]利用乳清分离蛋白与菊粉对植物乳杆菌进行包埋，结果证明微胶囊对益生菌具有保护作用；RAJAM R等[7]利用冷冻干燥法处理植物乳杆菌微胶囊，提高微胶囊包埋率和储存稳定性；MI Y等[8]利用羧甲基壳聚糖和海藻酸钠制备长双歧杆菌BIOMA 5920微胶囊，提高了其在肠道中的存活率。金云祥[9]以低甲氧基果胶为包埋材料，利用离子交联方法制备短双歧杆菌微胶囊，制成酸奶后添加到小鼠饲料中，促进改善宿主肠道微生态平衡、增强机体免疫耐受性、提升机体的抗氧化能力及肠道屏障功能。目前乳酸菌微胶囊的研究大多集中于单一菌种，不能更好的发挥乳酸菌调节肠道的功能，且将微胶囊应用于产品的研究较少。因此有必要对乳酸菌微胶囊在酸奶中的应用展开研究。

本研究以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）混合发酵液为芯材，羧甲基壳聚糖和海藻酸钠为壁材，采用挤压法制成植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌微胶囊，并将其添加到鲜牛乳中，添加发酵剂制成酸奶，通过单因素试验和正交试验，采用主成分分析对产品的酸度、黏度、pH、感官评分结果进行综合分析，优化酸奶工艺，对其理化和微生物指标进行检测，且通过体外模拟胃肠液试验，探究微胶囊酸奶中乳酸菌的存活率，为新型酸奶食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白砂糖：广西驮卢东亚糖业有限公司；鲜牛乳：内蒙古蒙牛乳业股份有限公司；发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌1∶1）：深圳安琪食品有限公司；果胶：沃佳生物科技有限公司；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：烟台南山学院实验室；MRS培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基：青岛海博生物技术有限公司。

盐酸标准溶液（分析纯）、氢氧化钠标准溶液（分析纯）：深圳市铖远科技有限公司；羧甲基壳聚糖、海藻酸钠（均为分析纯）：青岛美味源生物科技有限公司；氯化钙（分析纯）：西陇化工股份有限公司；胃蛋白酶（≥3 000 U/mg）、胰蛋白酶（≥2 500 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂。

1.2 仪器与设备

YP10002B电子天平：上海力辰仪器科技有限公司；PHS-3C pH计：上海虹益仪器仪表有限公司；NDJ-5S数显旋转黏度计：上海尼润智能科技有限公司；VS-1300L新颖型标准洁净工作台：广州深华生物技术有限公司；MSL-3781L高压蒸汽灭菌锅：松下电器（中国）有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；MJ-106B-Z恒温培养箱：上海博迅实业有限责任公司；FD-A10N-50冷冻干燥机：上海皓庄仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微胶囊的制备

活化后的嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌按照接种比例1∶1、接种量4%、培养温度37 ℃、培养时间18 h，摇床转速60 r/min培养后的混合发酵液为芯材[10]，选择质量分数为2.90%的羧甲基壳聚糖、质量分数为2.10%的海藻酸钠、浓度为0.20 mol/L的氯化钙为包埋材料，采用挤压法制备微胶囊，并进行冷冻干燥，即得微胶囊产品。

1.3.2 微胶囊酸奶的发酵工艺流程及操作要点

鲜牛奶、白砂糖、果胶→混合→均质→杀菌→冷却→接种→发酵→冷藏→微胶囊酸奶

操作要点：

混合：以200 mL鲜牛奶为基准，添加0.2%果胶和8%白砂糖，持续搅拌5 min，直至充分溶解。

均质：将混合液在转速为1 200 r/min条件下均质15 min。

杀菌：杀菌温度为90～95 ℃，杀菌时间10 min。

接种：向冷却至44 ℃左右的混合液中先加入0.20%发酵剂，再加入3%微胶囊，搅拌至混合均匀。

发酵：发酵温度为41 ℃，发酵时间9 h[9]。

冷藏：将发酵完成的酸奶转移到5 ℃冰箱中，放置12 h，即得微胶囊酸奶成品。

1.3.3 微胶囊酸奶配方优化单因素试验

固定微胶囊酸奶的基本条件为：鲜牛乳200 mL、发酵剂添加量0.20%、果胶添加量0.20%、白砂糖添加量8%、微胶囊添加量3%、发酵温度41 ℃、发酵时间9 h，以酸度、黏度、pH、感官评分为评价指标，分别考察微胶囊添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、白砂糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）、发酵剂添加量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）对酸奶黏度、酸度、pH和感官评分的影响。

1.3.4 微胶囊酸奶配方优化正交试验

在单因素试验的基础上，以黏度、酸度、pH、感官评分为评价指标，以微胶囊添加量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵剂添加量（C）为影响因素，进行三因素三水平正交试验，确定酸奶的最佳工艺配方。酸奶配方优化正交试验因素与水平见表1。

表1 酸奶配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for yogurt formula optimization

1.3.5 评价指标的测定

pH的测定：使用pH计对酸奶进行测定；酸度的测定：参照GB/T 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[11]进行测定；黏度的测定：使用NDJ-5S数显旋转黏度计，在室温下，装配4号转子，转速调至30 r/min，测定每组酸奶样品的黏度值[12-13]。理化和微生物指标参照GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[14]进行测定。

1.3.6 感官评价

邀请15名具备发酵乳感官评定专业知识的人员进行感官评定，参考GB/T 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[14]制定，采用百分制对酸奶产品的色泽（20分）、滋味和气味（40分）、组织状态（40分）进行感官评分，满分100分，具体评分标准见表2。

表2 酸奶感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of yogurt

1.3.7 体外模拟胃肠液试验

配制人工胃肠液[15-16]，试验分为两组，对照组（添加0.20%发酵剂+2.6%植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌菌粉）和试验组（添加0.20%发酵剂+3%植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌微胶囊），使得200 mL牛奶中发酵前两组活菌数相同（5×106CFU），分别取10 g酸奶样品加入到烧杯中，再加入90 mL人工模拟胃液，放入37 ℃、100 r/min的摇床摇匀1 h，参照GB/T 4789.35—2023《食品微生物学检验乳酸菌检验》[17]进行乳酸菌计数。然后分别取30 mL经胃液消化后的酸奶加入到烧杯中，加入70 mL人工模拟肠液，放入37 ℃、100 r/min的摇床摇匀2 h，计数方法同胃液。

1.3.8 数据处理与分析

采用IBM SPSS statistics 27软件，对单因素数据进行方差分析，利用主成分分析对酸奶的黏度、酸度、pH、感官评分四个指标进行综合分析得出特征值、方差贡献率及累积方差贡献率，再结合公式（1）（2）计算出酸奶的综合得分F和规范化得分Z[18-21]。

式中：F为综合得分，F1和F2分别为主成分1和主成分2的得分，Y1和Y2为各个主成分的特征值。Z为规范化得分，Fmax为综合得分的最大值，Fmin为综合得分的最小值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微胶囊添加量对酸奶品质的影响

微胶囊添加量对酸奶品质的影响见表3。由表3可知，随着微胶囊添加量不断增加，酸奶黏度逐渐增加，当微胶囊添加量为3%时，酸奶黏度为（374.00±43.36）mPa·s，与添加量1%相比，差异显著（P＜0.05），此后，随着微胶囊添加量的增加，黏度变化较小，与添加量3%相比，差异不显著（P＞0.05）。随着微胶囊添加量的增加，酸度和pH的变化很小，基本不发生改变，这主要是由于乳酸菌发酵的底物鲜牛乳量是相同的[22]；由于黏度增加，口感发生变化，在微胶囊添加量为3%时，感官评分为86.60±5.13分，此时产品色泽均匀，奶香味浓厚，感官评分为五组中最高。综合分析可得，最佳微胶囊添加量为3%。

表3 微胶囊添加量对酸奶品质的影响Table 3 Effect of microencapsulation addition on yogurt quality

2.1.2 白砂糖添加量对酸奶品质的影响

白砂糖添加量对酸奶品质的影响见表4。由表4可知，随着白砂糖添加量的增加，酸奶黏度增加，当添加量达到8%时，与添加量6%相比，差异不显著（P＞0.05），白砂糖添加量达到9%时，与添加量6%相比，差异显著（P＜0.05），黏度过大[23-24]；随着白砂糖添加量的增加，酸度逐渐增大，pH值逐渐降低，当添加量为8%时，感官评分为87.20±8.46分，此时产品口感酸甜顺滑，甜而不腻，无颗粒感，感官评分为五组中最高。综合分析可得，最佳白砂糖的添加量为8%。

表4 白砂糖添加量对酸奶品质的影响Table 4 Effect of sugar addition on yogurt quality

2.1.3 发酵剂添加量对酸奶品质的影响

发酵剂添加量对酸奶品质的影响见表5。由表5可知，随着发酵剂添加量的增加，酸奶黏度不断增加，与添加量0.10%相比，添加量0.20%时黏度显著增加（P＜0.05），但由于过度发酵使部分乳清析出，酸奶的黏度降低，导致酸奶黏度呈现先增加后降低的趋势[25-26]。因底物鲜牛乳的量一定，随着发酵剂添加量的增加，酸度逐渐上升，与添加量0.10%相比，添加量0.20%时酸度显著增加（P＜0.05），但后期可被转化的糖不足，酸奶酸度会保持基本不变，因此酸奶的酸度呈先增加后平稳趋势[27]，pH值相应呈降低趋势。当发酵剂的添加量为0.20%时，酸奶黏度为（410.00±71.06）mPa·s，酸度为（132.20±6.38）°T，pH值为5.48±0.47，感官评分为（85.60±6.94）分，此时产品感官评分为5组中最高。综合分析可得，最佳发酵剂的添加量为0.20%。

表5 发酵剂添加量对酸奶品质的影响Table 5 Effect of starter addition on yogurt quality

2.2 微胶囊酸奶配方优化正交试验

2.2.1 主成分分析及规范化得分计算

采用IBM SPSS statistics 27软件，对成品的黏度、酸度、pH、感官评分指标进行主成分分析得出特征值、方差贡献率及累积方差贡献率，主成分特征值及贡献率见表6，提取的主成分矩阵见表7。

表6 主成分特征值及方差贡献率Table 6 Characteristic value and contribution rate of principle components

表7 主要指标的特征向量Table 7 Characteristic vector scale of main indicators

由表6可知，第1主成分方差贡献率为61.38%（Y1），第2主成分方差贡献率为26.48%（Y2），前2个向量累积方差贡献率为87.87%，根据累积贡献率大于85%的原则，表明提取的前2个主成分能够全面反映酸奶的综合品质。由表7可知，决定第1主成分的指标为酸度；决定第2主成分的是感官评分。

根据主成分分析结果，得出相应的F1、F2，再根据公式（1）和（2）得出主成分分数及规范化得分，以规范化得分作为正交试验评价指标，得到主成分得分与四个变量之间的关系为：

F1=0.48X1+0.59X2+0.57X3+0.27X4

F2=0.36X1-0.30X2-0.36X3+0.80X4

2.2.2 正交试验结果与分析

以微胶囊添加量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵剂添加量（C）为试验因素，以规范化得分为评价指标，进行3因素3水平正交试验，正交试验测定结果见表8。

表8 酸奶配方优化正交试验结果与分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for yogurt formulaoptimization

从表8中的R值可以得知，对规范化得分的影响顺序为C（发酵剂添加量）＞B（白砂糖添加量）＞A（微胶囊添加量），酸奶最佳发酵工艺为A1B2C2，即发酵剂添加量0.2%，白砂糖添加量8%，微胶囊添加量2%，发酵时间9 h，发酵温度41℃，在此条件下，酸奶规范化得分为1.00，黏度为410mPa·s，酸度为137°T，pH为5.2，感官评分为85，规范化得分为1.00。

由表9可知，微胶囊的添加量对黏度的影响极显著（P＜0.01），对酸度、感官评分、pH和规范化得分的影响不显著（P＞0.05）。白砂糖的添加量对黏度的影响极显著（P＜0.01），对感官评分的影响显著（P＜0.05），对酸度和规范化得分的影响不显著（P＞0.05）。发酵剂添加量对黏度的影响极显著（P＜0.01），对酸度、pH、感官评分和规范化得分的影响显著（P＜0.05）。

表9 正交试验结果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests results

2.3 理化和微生物指标检测结果

酸奶产品中脂肪含量4 g/100 g，酸度121°T，蛋白质含量3.1 g/100 g，乳酸菌2.5×106CFU/mL，大肠菌群、酵母菌、霉菌均未检出，符合我国乳制品国家标准GB/T 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》。

2.4 体外模拟胃肠液试验结果

微胶囊酸奶体外稳定性试验结果见表10。

表10 体外模拟胃肠液试验结果Table 10 Results of simulated gastrointestinal fluid experiments in vitro

由表10可知，在人工胃液中，对照组乳酸菌存活率为31.39%，试验组乳酸菌存活率为67.60%，存活率增加36.21%。在人工肠液中，对照组乳酸菌存活率为28.06%，试验组乳酸菌存活率为62.00%，存活率增加33.94%，表明生产酸奶时添加乳酸菌微胶囊，可大幅提高酸奶中乳酸菌活性。

3 结论

本研究将植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌微胶囊加入到鲜牛乳中制作酸奶，通过单因素试验和正交试验，采用主成分分析对产品的酸度、黏度、pH、感官评分结果进行综合分析，优化酸奶工艺。确定最佳生产工艺为：发酵剂添加量0.2%，白砂糖添加量8%，果胶添加量0.2%，微胶囊添加量2%，发酵温度41 ℃，发酵时间9 h。最终生产的酸奶色泽均匀，质地细腻，组织状态均匀，感官评分为85分，其黏度、酸度、pH分别为410 mPa·s、137°T、5.2，理化和微生物指标均符合国家标准，且乳酸菌以酸奶为载体到达肠道后可以保持较高的活性，发挥益生功能，为新型酸奶食品的研发提供参考依据。