扩大分散液液微萃取法测定水中20种有机氯和菊酯农药残留

芮鸿飞，吴俊，罗淑文，欧阳晓洁，刘晓颖，吴峰华

(1.杭州市临安区疾病预防控制中心，浙江 杭州 311300；2.浙江农林大学 现代农学院，浙江 杭州 311300)

有机氯农药(organochlorine pesticides，OCPs)作为主要的杀虫剂，在我国20世纪60—70年代曾广泛使用[1]，是一类重要的难降解有机物，具有生物累积性、生物放大作用和致癌、致畸、致突变作用[2-3]。80年代开始，我国对部分有机氯农药已严令禁止生产和使用，但由于有机氯难降解，在国内外很多水体和沉积物中仍能检测到它们的存在[4]。拟除虫菊酯类农药(pyrethroid pesticides)是一类能防治多种害虫的广谱杀虫剂，对昆虫具有强烈的触杀作用，具有低毒、高效、低残留的特点，在农作物生产过程中使用广泛[5]。菊酯类农药对哺乳动物具有中等的免疫系统毒性、神经毒性等多种潜在的毒性，人体长期接触低剂量的菊酯类农药也会引起慢性疾病[6]。

由于有机氯和拟除虫菊酯农药存在一定的同分异构体，且受样品本身基质的影响，这2类农药残留检测较为困难。目前，有机氯和拟除虫菊酯检测方法有气相色谱法、气相质谱法、液相色谱-质谱联用等方法，常见的前处理方式有液液萃取、固液萃取、固相萃取、固相微萃取、悬浮固化微萃取和DLLME[7-8]。其中，DLLME是在液液萃取的基础上进行改进的，通过形成水相、分散剂、萃取剂三元浑浊体系，增大了目标物与萃取剂的接触面积，从而高效快速地将目标物萃取出来[9]。与传统萃取技术相比，DLLEM具有有机试剂用量少、萃取时间短、富集倍数高等优点，因而被广泛应用[10]。但DLLME最终样液往往只有十几甚至几微升，无法通过仪器批量自动进样，且易挥发，给实验过程带来不便。

本文将液液分散微萃取体系扩大，建立了扩大分散微萃取结合GC-ECD测定饮用水中20种有机氯和菊酯农药残留方法，优化了DLLME萃取体系中提取剂和分散剂的种类和体积、盐含量、萃取时间等条件。该方法简单、稳定可靠，最终样液体积能够满足自动进样的要求，拓展了DLLME应用的范围，使实验更具有可操作性，可为相关检测和日常监管工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津2010plus气相色谱仪，配ECD检测器(日本岛津公司)；高速冷冻离心机，Heraeus Multifuge X1R(Thermo Fisher Scientific)；电子天平，JJ600Y(常熟市双杰测试仪器厂，常熟)；氮吹仪，N-EVAP112(USA Organomation)；涡旋振荡器，MS 3 B S25(GER IKA)；离心机，mini G S25(GER IKA)；数控超声波清洗器，KQ-500DE(昆山市超声仪器有限公司，昆山)；250 μL内插管(美国安捷伦公司)。

20种有机氯及菊酯标准品(浓度为100 μg·mL-1的、α-六六六、六氯苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、七氯、环氧七氯、硫丹、p，p′-DDE、p，p′-DDT、o，p′-DDT、p，p′-DDD、三氯杀螨醇、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯)，购于北京标样部。三氯甲烷(分析纯)购于华东医药股份有限公司，四氯化碳(分析纯)、四氯乙烯(分析纯)均购于Aladdin公司，乙腈(色谱纯)、正己烷(色谱纯)均购于TEDIA公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

分别移取各有机氯标准原液1.0 mL于25 mL容量瓶中，正己烷定容，得到浓度4.0 μg·mL-1的有机氯准备溶液，移取各拟除虫菊酯原液1.0 mL于10 mL容量瓶中，正己烷定容，得到浓度为10 μg·mL-1的有机氯储备溶液；然后将有机氯储备溶液稀释成0.10 μg·mL-1、拟除虫菊酯储备溶液稀释成0.2 μg·mL-1的标准使用液，再逐阶稀释成系列梯度溶液，待分析。

1.2.2 样品前处理

取40 mL水样置于50 mL离心管中，加入4 mL乙腈(分散剂)，混匀后，加入400 μL三氯甲烷(萃取剂)，漩涡振荡30 s，以5 000 r·min-1的速度离心3 min，将下层三氯甲烷沉积相(210 μL)吸出，置于1.5 mL塑料离心管中，氮吹至干，100 μL正己烷复溶，吸出置于有250 μL内插管的进样瓶中，待GC-ECD分析。

1.2.3 色谱条件

DB-5石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm，美国安捷伦)；进样口温度为220 ℃；ECD检测器温度为320 ℃；载气为高纯氮，柱流量为1 mL·min-1；升温程序：80 ℃保持1 min，以40 ℃·min-1速率升至160 ℃，以5 ℃·min-1上升至200 ℃(保持5 min)，以8 ℃·min-1上升至240 ℃，以5 ℃·min-1上升至290 ℃(保持3 min)，以30 ℃·min-1上升至300 ℃(保持3 min)；进样方式为分流进样，分流比为1∶10，进样量为1.0 μL。

1.3 计算方法

分散液液萃取中富集因子(enrichment factor，EF)和萃取回收率(extraction recovery，ER)是判断DLLME方法有效率的重要参数。EF的定义为萃取后有机相中分析物的浓度(Csed)与萃取前水中分析物浓度(C0)的比值，即：EF=Csed/C0；ER是萃取后有机相中分析物的含量(n)相对于样品中分析物含量(n0)的占比，即ER=n/n0。

1.4 数据分析

采样Excel 2007和SPSS 22.0进行数据整理和分析。萃取效率研究时，同分异构体以总面积进行比较。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确认

分别利用DB-5(30 m×0.25 μm×0.25 μm)、RTX-5(30 m×0.25 μm×0.25 μm)、SK-5(60 m×0.25 μm×0.25 μm)对20种有机氯及拟除虫菊酯标准溶液进行色谱分析，RTX-5的p，p′-DDT和o，p′-DDD出现峰重合现象，DB-5和SK-5色谱柱的峰形较好，但SK-5色谱柱色谱时间过长，因此，选用DB-5色谱柱，对程序升温的初始温度及升温速率进行优化，结果见1.2.3节。同时考虑到p，p′-DDT、p，p′-DDD等组分会因进样时温度过高而降解[11]，导致回收率偏低，因此，进样口温度控制在220 ℃，以保证回收率。在此条件下，20种有机氯及拟除虫菊酯实现了基线分析，各组分之间无干扰，且各组分不受水体基质的影响，加标色谱见图1。

1—α-666；2—六氯苯；3—β-666；4—γ-666；5—δ-666；6—七氯；7—环氧七氯；8—硫丹-Ⅰ；9—p，p′-DDE；10—硫丹-Ⅱ；11—p，p′-DDT；12—o，p′-DDD；13—p，p′-DDD；14—三氯杀螨醇；15—联苯菊酯；16—甲氰菊酯；17—氯氟氰菊酯；18—氟氯氰菊酯；19—氯氰菊酯；20—氰戊菊酯；21—溴氰菊酯。图1 20种有机氯和菊酯农药加标色谱图Fig.1 Chromatograms of 20 organochlorine and pyrethroid pesticides

2.2 扩大分散液液微萃取条件的确认

2.2.1 萃取溶剂的选择

萃取剂的选择对提取效率影响显著，一般所选用的提取剂应该密度大于水且不溶于水，对目标物有良好的提取能力，性质稳定，色谱峰良好且与目标物区[12]。本研究选择了三氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烯作为提取剂进行实验，移取有机氯及菊酯农药标准使用液各10 μl于40 mL超纯水中，制得0.5 μg·L-1的有机氯及菊酯农药模拟水样，分别用400 μL三氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烯作为萃取剂，在4 mL乙腈为分散剂的条件下进行实验。由图2可知，四氯化碳作为萃取剂萃取效率最差，三氯甲烷和四氯乙烯较好，同时三氯甲烷比四氯乙烯稳定性更佳，因此，本实验选取三氯甲烷作为最佳萃取剂。

图2 萃取剂种类对DLLME萃取效率的影响Fig.2 Effect of extractant type on DLLME extraction efficiency

2.2.2 萃取剂体积的选择

萃取剂的用量决定了方法的富集倍数和萃取效率。本实验考察了不同三氯甲烷体积(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL)对方法富集倍数和萃取效率的影响，结果如图3所示。随着萃取剂体积的增加，峰面积逐渐减少，富集效率越低。当三氯甲烷为0.2 mL时，因体积过小，无法对目标物进行充分提取，且最终沉积相体积约90 μL，体积过小时，偏差较大，且溶剂置换后再次被稀释，所以峰面积相差较大。综合考虑操作性，三氯甲烷体积选择0.4 mL进行实验。

图3 萃取剂体积对DLLME富集效率的影响Fig.3 Effect of extractant volume on DLLME enrichment efficiency

2.2.3 分散剂的选择

分散剂可以促使萃取剂形成微小液滴，使萃取剂均匀分散于溶液中，增大萃取剂与目标物的接触面积，从而提高萃取效率；实验通常要求分散剂有良好的色谱行为，以及萃取剂在其中的溶解性要大于在水中的溶解性[13]。本实验对不同分散剂(甲醇、乙腈、丙酮)进行考察，选用甲醇作为分散剂时，可能是由于甲醇在水溶液中的溶解度较大，导致离心后沉积相较少，萃取效率较低；用乙腈和丙酮作为分散剂时萃取效率接近，但丙酮作为分散剂时，α-666、六氯苯、β-666和氯氟氰菊酯的重复性较差，所以选择乙腈作为分散剂。

2.2.4 分散剂体积的选择

分散剂的用量影响着三元浑浊体系的形成，理论上，在一定范围内增加分散剂的用量，其萃取效率会随之增大；然而，当分散剂用量过多时，萃取剂会大量溶解于其中，进而导致目标物在水中的溶解度增大而不易被萃取出来[13]。本文考察了不同乙腈体积(2、3、4、5、6 mL)对萃取效率的影响，随着乙腈体积的增加，萃取效率也随之增加，当乙腈超过5 mL后，提取效率逐渐降低。4 mL乙腈的萃取效率和5 mL乙腈萃取效率差异不大，综合考虑选择乙腈体积为4 mL。

2.2.5 盐离子浓度的影响

研究[14]表明，适当增加水中盐浓度可以使目标分析物在水中的溶解度减小，从而提高有机溶剂对目标分析物的提取效率。基于此，本研究在保持其他条件不变的情况下通过向水样中添加不同量的NaCl(0.0%、2.5%、5.0%、10.0%、15.0%)，考察了盐效应对萃取效果的影响。结果表明，盐浓度对提取效率影响不显著，当盐浓度增加时，p，p′-DDT和氟氯氰菊酯等组分的萃取效率反而有所降低，这是由于随着水中盐浓度的增加，目标分析物在水中溶解度减少的同时，萃取剂在水中的溶解性也随之降低，从而导致萃取溶剂体积变大，富集系数变小，萃取效率降低；同时盐含量的增加，也使水中目标分析物的传质系数变差，从而影响萃取效率[15]。实验过程中还发现，NaCl中的部分农残本底也对提取过程造成一定的影响。因此，本实验选择不添加NaCl。

2.2.6 萃取时间的影响

萃取时间即萃取剂、分散剂、水3项混匀萃取的时间。本实验对不同萃取时间(15、30、90、120 s)进行了比较，结果表明，萃取30 s比萃取15 s的萃取效率略有增加，30 s后，萃取时间对各组分萃取效率影响不显著，因此，本实验选取30 s为萃取最佳时间。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线和检测限

配置0.002～0.10 μg·mL-1的有机氯及0.01～0.20 μg·mL-1的拟除虫菊酯混标系列溶液，按上述优化后的条件处理，进行GC-ECD分析。以标准系列梯度溶液的浓度为横坐标，以各组分峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；将加标样品梯度稀释后进样，以(S/N)≥3计算方法检出限，以(S/N)≥10计算方法定量限(表1)。20种有机氯及拟除虫菊酯分别在0.002～0.10 μg·mL-1、0.01～0.20 μg·mL-1范围内曲线良好，r>0.998，检出限在0.001～0.002 μg·L-1，定量限在0.003～0.00 6 μg·L-1，方法富集倍数在168～206，与相关研究[16-18]的报道相近。

表1 20种有机氯及拟除虫菊酯农药的线性范围、线性方程、检出限Table 1 Linear ranges，linear equations and detection limits of 20 organochlorine and pyrethroid pesticides

2.3.2 回收率和精密度

以空白自来水为研究对象，加入一定量的有机氯及拟除虫菊酯标准溶液，配成各组分浓度为0.025、0.05、0.25 μg·L-1的加标水样，按上述前处理方法处理后检测分析，重复6次，计算其相对标准偏差(RSD)。由表2可知，各组分在3个水平浓度上的加标回收率在83.30%～116.70%，RSD在0.84%～9.87%，表明本方法准确性高，稳定性好，能够满足饮用水中20种有机氯及拟除虫菊酯残留的测定。

2.3.3 自来水样本的测定结果

对135个农村饮用水进行检测。检测结果显示，水样中未检出拟除虫菊酯；有不同浓度的有机氯农药检出，检出率最高的是七氯(55.8%)和γ-HCH(38.2%)，检出浓度最高的是六氯苯，其浓度范围为1.7～132.5 ng·L-1，平均浓度为21.6 ng·L-1，γ-666的检出浓度仅次于六氯苯，浓度范围为1.5～127.4 ng·L-1，平均浓度为17.3 ng·L-1。所测水样中OCPs均远低于GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》及美国国家环境保护局(US EPA)中规定的OCPs的限量值。

3 结论

本文建立了扩大分散微萃取结合GC-ECD测定饮用水中20种有机氯和菊酯农药残留方法，结果表明，该方法具有良好的回收率和重复性，操作简单，能够满足自动进样时最终样液体积的要求，使实验更具有可操作性，适合大批量检测水中多组分农药残留的实际需要。