HS-SPME-GC-MS鉴定不同采收程度霞晖水蜜桃的风味物质变化

王塔娜，陈小龙，张佳辉，王冬兰，王亚，宋立晓，马凤鸣，余向阳*

(1.沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.江苏省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，江苏 南京 210014；3.省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室，江苏 南京 210014)

桃(PrunuspersicaL. Batsch)隶属于蔷薇科，作为一种核果类果树在世界各地均有栽培，是我国主要培育的果树。水蜜桃因浆汁丰富，柔软可口，甘甜鲜美而深受人们的喜爱。霞晖8号是江苏省农业科学院园艺研究所2001年分别以中熟水蜜桃朝晖和中熟油桃瑞光18号为母本与父本进行人工杂交后，由四川省农业科学院园艺研究所2009年引进而成，2012年11月通过江苏省农作物品种审核评定委员会鉴定并命名的晚熟桃品种[1]。果实内部品质是其评价指标的重要组成部分，果实品质指标包括感观品质、营养价值、化学组成、机械加工性能和产品缺陷等[2]。其中香气和滋味是感官品质指标的重要体现，主要取决于构成特征风味的化合物种类。在果实发育成熟与贮藏的过程中，风味物质的形成、释放与代谢起着特别重要的作用[3]。研究人员通常希望通过对果品中香气成分的检测所得到的信息来评价其成熟程度，并结合其他化学计量学手段等[4-7]，以期为水蜜桃精准采摘、智慧化采摘提供科学依据。

风味是指品尝时嗅觉、味觉和三叉神经这3种感觉特征的复杂结合，具体包括人们能感觉到的香气、味道、口感以及外部特征[4]。有关桃果实风味物质的研究国内外已有报道[8-17]，迄今为止已有数百种桃果实的香气成分被鉴定，主要包括醇类、醛类、烃类、酯类、酮类、内酯类和萜类等[2]。Horvat等[18]用毛细管气液相色谱法和气液相色谱-质谱法检测到苯甲醛、芳樟醇、γ-癸内酯和δ-癸内酯等是桃果实的主要风味物质。一般认为，酯具有水果香味和花香味，其中γ-癸内酯具有桃子独特的强烈果香味，而苯甲醛赋予了桃果实良好的风味品质[19]。近年来随着水蜜桃的种植面积不断扩大，人工采摘成本增高，智慧化精准采摘技术需求越来越大。因此，明确水蜜桃不同成熟度特征香气成分，找出其特征差异物质，并结合人工智能发展，可为水蜜桃省力化栽培发展提供基础依据。

顶空固相微萃取技术(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)是一种基于固相萃取技术的样品分析预处理新技术，此技术分析前无需人工预浓缩，具有操作便捷、快速高效、安全环保、低成本等优点，常与色谱仪器联合进行检测[20]。本研究利用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)结合气相色谱—质谱联用仪(GC-MS)对霞晖水蜜桃果实中的风味物质进行测定，寻找水蜜桃果实内的香气成分差异物质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用样品为江苏省农业科学院溧水基地采摘的霞晖水蜜桃，采摘后24 h内运回实验室，经专业技术人员确认后，将有病斑、表面损伤等外观异常的样品剔除，在进行理化检测时，同时将内部有病变的果实也从样品集中剔除。随后按照人工经验并结合样品的颜色、大小和硬度手动分成可采收和不可采收两个类别(图1)，每个成熟度共10份样品，每份样品30个桃样品混合，共计600个桃样品。

图1 霞晖水蜜桃可采收和不可采收样品Fig.1 Harvestable and non-harvestable samples of Xiahui

1.2 样品制备

每份样品中每个鲜桃采用四分法分成4份，取对角线的2份进行混合切块，30个样品混合后再切碎混匀用液氮速冻，然后放入研磨机(德国IKA艾卡)中进行匀浆，研磨机转速为20 000 r·min-1，时间为50 s。

取3.0 g匀浆后的样品置于20 mL顶空进样瓶中，将顶空瓶放入恒温水浴锅中，将已老化的进样针插入密封的顶空瓶中，在60 ℃水浴中萃取1 h取出，立即插入GC-MS进样口中，热解析3 min。每次萃取样品前将萃取头于250 ℃下老化5 min，达到降低记忆效应的目的。

1.3 GC-MS分析条件

仪器型号为Thermo Fisher(赛默飞)TSQ8000EVO，色谱柱为TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱；载气为高纯氦气(纯度99.999%)；载气流速为1.2 mL·min-1；采用不分流的进样方式；程序升温：初始温度40 ℃保持2 min，然后以6 ℃·min-1升至280 ℃，保持4 min；进样口温度为250 ℃。

质谱的离子源为EI源，电子能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；离子源温度：300 ℃；扫描范围(m/z)：33～500 amu，采用全扫描的模式进行采集。

1.4 数据处理

定性分析：将Xcalibur工作站与NIST 17质谱库提供的标准质谱图进行对照，分析匹配度大于800的成分作为鉴定结果；利用NIST谱图库的数据处理系统按峰面积归一化法进行定量分析，求得各化学成分在水蜜桃果实挥发性成分中的百分含量。

2 结果与分析

2.1 可采收与不可采收水蜜桃风味物质对比

采用HS-SPME结合GC-MC提取可采收与不可采收霞晖水蜜桃中的风味物质，总质子流色谱图(TIC)如图2所示。从图中可以看出，不同采收程度的水蜜桃样品色谱图有差别，4.7～24.6 min内均有较大差异。

图2 不同采收程度的霞晖水蜜桃果实风味物质GC-MS总质子流色谱图Fig.2 GC-MS total proton flow chromatography of flavor substances in Xiahui fruits with different harvest levels

2.2 霞晖水蜜桃果实的香气成分

通过统计分析鉴定到的风味物质化学成分见表1。霞晖水蜜桃共分离得到45种物质，主要包括醇类11种，酯类3种，内酯2种，醛类6种，酮类3种，酸类5种，胺类4种，烷烃类4种，其他类别7种(图3)。邓翠红等[21]在大久保桃果实中鉴定出41种风味物质，主要包括挥发性醇类(11%)、醛类(16%)、酮类(24%)、酯类(28%)、酸类(2%)，其他物质占19%。李明等[17]在不同成熟期的3个品种桃果实中分别检测出60、69和73种香气成分，主要种类为酯类、醇类、醛类和内酯类化合物。

表1 鉴定得到的霞晖水蜜桃果实风味物质成分Table 1 Identified flavor components of Xiahui fruit

图3 霞晖水蜜桃果实各风味物质所占比例Fig.3 Proportion of various flavor substances in Xiahui fruit

由表1和图3可见，霞晖水蜜桃果实的风味物质中醇类(20%)占比最大，主要包括具有花香味的芳樟醇、柠檬香味的1-十一醇、甜花香气的正癸醇以及紫丁香味的4-萜烯醇等。醛类(14%)主要包括具有樱桃及坚果香的苯甲醛、强烈脂肪香气的十二醛和青草味的己醛等。酸类(11%)主要是具有水果特殊香气的十一烯酸、脂肪香气的壬酸等。酯类(8%)和内酯类(6%)中具有强烈桃子香气的γ-癸内酯、γ-十二内酯以及菠萝和苹果香气的辛酸乙酯等。

2.3 不同成熟度主要风味物质的聚类分析

聚类分析结果如图4所示，不可采收与可采收样品分别为样品1～10与样品11～20，图4将20份样品聚为2类，除样品13与样品15聚类有误，其他样品均与人工分类一致，说明经验分类具有较高的准确性。从纵向来看，检出的化合物共聚类为2类，一类主要为有机酸，另一类主要为醇、醛、酯类。

2.4 不同风味物质的差异倍数与差异值分析

如图5所示，样品不同风味物质的差异倍数和差异含量值均有较大差别。随着果实的成熟，秋水仙素、己醇和氧杂环十二烷-2-酮等10个化合物的含量逐渐升高，苯甲醛、1-十一醇、正癸醇、倍氯米松双丙酸酯、壬酸、肼羧酸苯甲酯和麦角酰胺共7个化合物的含量降低(图5中a)。在可采收的成熟样品中鉴定出35种化合物，主要为γ-十二内酯、长春胺、十二(碳)烯、辛酸乙酯、十一醛、芳樟醇和十一烯酸等化合物。在不可采收的未成熟样品中鉴定出31种化合物，主要为苯甲醛、十一醛、壬醛、辛酸乙酯、芳樟醇、环氧异长叶烯、十六烷和2，6-二叔丁基苯醌等化合物。

己醇、环十五醇、2-乙基己醇、2-丙基戊醇、2-硝基-2-氯丙烷、二乙基甲基硅烷、二十烷、N-乙酰秋水仙醇甲醚、二甘醇己基醚、二硫胺、己醛、十五烷酸共12种化合物仅为可采收的样品中鉴定出，而1-十四醇、1-十一醇、4-萜烯醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、正十五烷、十六烷、肼羧酸苯甲酯、倍氯米松双丙酸酯、异环磷酰胺、麦角酰胺、十二醛、2，6-二叔丁基苯醌以及12-羟基，顺-9-十八碳一烯酸共13种化合物仅在未成熟桃中检测出。

共有24种化合物随着成熟度的增加而降低，主要为环氧异长叶烯、视黄醛、1-十四醇、十二醛、十一醛、9，10-十四碳烯醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、正十五烷、反式-2-己烯基己酸、2-蒈烯、2，6-二叔丁基苯醌、γ-十二内酯、12-羟基，顺-9-十八碳一烯酸、4-萜烯醇、十六烷、异环磷酰胺、芳樟醇、麦角酰胺、肼羧酸苯甲酯、壬酸、倍氯米松双丙酸酯、正癸醇、1-十一醇、苯甲醛，尤其如图5中b所示，苯甲醛、1-十一醇、正癸醇3种化合物的相对含量值减少最大，分别为-21.15%、-18.5%、-6.04%。因此，苯甲醛、1-十一醇、正癸醇为未成熟水蜜桃中特征风味物质，苯甲醛具有苦杏仁味是桃中苦涩味的主要贡献者，而1-十一醇与正癸醇分别具有柠檬香味与花香味，是未成熟桃中挥发性酸味贡献者。

γ-癸内酯、1-十二(碳)烯、氧杂环十二烷-2-酮、秋水仙素、2-硝基环己酮、辛酸乙酯、长春胺、壬醛、2，4-二叔丁基苯酚、4-异丙基环己酮、十一烯酸共11种化合物随成熟度增加而增加，尤其如图5中b所示，γ-癸内酯的相对含量增加值最大为11.58%，γ-癸内酯是成熟桃中桃香味的主要贡献者。

2.5 风味物质的特征香气分析

风味阈值(threshold value)指人的嗅觉器官能够感受到的呈香呈味化合物所需的最小浓度值，因此，当物质的风味阈值越小时，人们越能敏锐地感受到。表2总结了现有报道的18种风味物质的阈值与香气特征，正癸醇的风味阈值最高为100 μg·L-1，因此，虽然检测出该物质但实际品尝过程中很难利用嗅觉辨别出正癸醇所带的花香味，与之相反的苯甲醛的阈值最低仅为0.001 μg·L-1，因此，在桃子未成熟时很容易表现为苯甲醛的特征苦涩味。而己醛、芳樟醇、壬醛、辛酸乙酯、壬酸、2-乙基己醇6种化合物的风味阈值范围为1～10 μg·L-1，因此，果实的风味并不只是取决于芳香物质的浓度值，每一种挥发性香气成分对果实香气的贡献是由其风味阈值来主导的[22]，不同芳香物质的浓度值与风味阈值共同决定了其特有的感官感受。虽然现阶段已经有较多芳香物质的风味阈值被确定，但表征桃香味的γ-癸内酯、γ-十二内酯还有待后续研究。

表2 霞晖水蜜桃果实部分风味物质的香气特征单位Table 2 Aroma characteristic units of some flavor substances in Xiahui fruit

3 分析与讨论

果实的香气是随着果实的成熟而形成的。研究表明，针对于部分呼吸跃变型果实而言，绝大多数挥发性成分是在呼吸跃变开始之后产生的[23]。如Song等[24]和Bangerth等[25]研究表明，过早采收的苹果果实(呼吸高峰前4周)的香气物质很少，总量远远低于采收果实的呼吸高峰期。陈成等[26]的研究认为，金艳猕猴桃在盛花期后160 d时，这个时期具有最多的酯类香气种类，内在品质最好，也就是适宜采收的时期。梁水连等[27]对香蕉果实的不同后熟时期进行了挥发性物质的分析，结果表明，成熟阶段其不同香气成分的种类和含量有较大差异，绿熟期和过熟期的香气种类最多，分别以反式-2-壬醛和乙酸异戊醇为主，该时期最适合开发食品香精。但不同水果其香气种类与特征香气成分具有较大差别。

韦节华[28]采用SPME-GC-MS对不同采收期的肥城桃香气成分进行了检测和分析。研究结果表明，随着果实逐渐成熟，风味物质中酯类化合物的变化最显著，其种类和总含量明显提高，其中反式-己酸-2-己烯酯和乙酸异丙烯酯只在成熟前期检测到，而辛酸乙酯和丁酸乙酯在成熟后期才被检测到。Jia等[12]报道了清香型的C6醛类如己醛和醇类如己醇等在未成熟的白肉桃品种中为主要成分。Visai等[29]的研究表明，随着桃果实的成熟，C6醛类和醇类的含量有所下降，但果香型的γ-十内酯、δ-十内酯以及花香型的苯甲醛含量明显增加，并在成熟的桃果实中达到最大值。由霞晖水蜜桃未成熟不可采摘与成熟可采摘鉴定到的化合物比较得出，在果实逐渐成熟的过程中，香气成分的种类与含量有较大的差异。酯类化合物如辛酸乙酯，内酯类化合物如γ-癸内酯，酮类化合物如2-硝基环己酮和4-异丙基环己酮等，相对含量差异倍数均大于0.1；醛类化合物如苯甲醛呈现先升高后降低的趋势，与前人的研究在化合物种类与变化趋势上具有一定差异，这可能与样品的品种和成熟度有关。

4 结论

本研究通过采用HS-SPME-GC-MS对霞晖水蜜桃果实中的风味物质鉴定，发现霞晖水蜜桃果实的主要风味物质包括内酯、醛类、酮类、酸类、胺类、烷烃类和其他类别；其中主要的风味物质为苯甲醛、正癸醇、1-十一醇、壬醛、γ-癸内酯、芳樟醇、长春胺、壬酸、2-硝基环己酮、十一醛、1-十二(碳)烯、反式-2-己烯基己酸和2-乙基己醇等。聚类和差异值分析表明，不可采收的霞晖水蜜桃果实和可采收的霞晖水蜜桃果实中差异特征风味物质分别是苯甲醛(35.84%)降低和γ-癸内酯(17.81%)升高，其中苯甲醛的阈值最低仅为0.001 μg·L-1时，在桃子未成熟时可以感受到其特征苦涩味。随着果实的成熟，酯类、内酯类和酮类化合物的含量降低，醛类化合物是未成熟桃果实中主要的香气成分，而内酯类化合物构成了桃香气的尾韵。由此可见，香气成分可以作为水蜜桃成熟度的判别和品质评价的重要指标，本研究以期为水蜜桃智慧化采摘、省力化栽培发展提供基础数据和科学依据。