齐墩果酸对B淋巴细胞损伤的保护作用并基于网络药理学探索其作用机制

代雨鑫，梁立春，彭琳茜，孟凡奇，韩献锋，张 玥，杨 玉，商 宇，

(1.佳木斯大学基础医学院微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江 佳木斯154007；2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江佳木斯 154003)

齐墩果酸是一种五环三萜类化合物，其化学名称为3β-羟基齐墩果烷-12-烯-28-酸，在苹果表皮、番木瓜果实、柿子的果实、李子、枇杷、大豆等多种植物与食物中广泛存在[1]。齐墩果酸具有抗肝损伤、抗氧化、抗炎症、抑制血小板聚集、降血糖和抗肿瘤等多方面的药理作用，目前已经用于临床治疗急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎[2]。齐墩果酸具有免疫调节作用。在实验性自身免疫脑脊髓炎小鼠中，齐墩果酸能够使促进炎症与抑制炎症的免疫反应趋于平衡，并且促进自身免疫性脑脊髓炎相关肠道功能损伤的恢复[3]。本研究团队之前也发现齐墩果酸能够促进免疫缺陷小鼠肠道免疫功能的恢复[4]。

网络药理学是综合利用网络分析、系统生物学和药理学等方法研究多组分、多靶点、多通路的药物作用机制的学科，其通过构建药物-靶点-疾病网络揭示复杂疾病的发生机制和药物治疗的方式，并为新药开发提供候选目标或方向[5]。体液免疫力是人体抵抗病原体感染、消除抗原性异物、保障健康的关键防线，其减弱将导致机体更容易遭受疾病的侵袭[6]。基于此，本文从B 淋巴细胞发育的角度探索了齐墩果酸对体液免疫的调节作用。为了阐述其作用机制，我们利用网络药理学手段筛选了齐墩果酸的药物靶点，并对其药物靶点进行了蛋白质相互作用网络分析、基因本体(gene ontology，GO)生物过程分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析。

1 材料与方法

1.1 动物实验

1.1.1 主要试剂及仪器齐墩果酸(纯度≥98%)、环磷酰胺(纯度≥98%)、红细胞裂解液均购于北京索莱宝科技有限公司；RPMI-1640 培养液购于美国思拓凡公司；Anti-CD45R(B220)-APC购于杭州联科生物技术股份有限公司；Anti-IgD-PE 购于美国赛默飞世尔科技公司；BD FACSAriaTMCell Sorter 流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.1.2 实验动物SPF 级昆明种雌性小鼠24 只(合格证号230781211100005414)，购于哈尔滨珍宝制药有限公司，饲养于佳木斯大学实验动物中心，许可证号为SYXK(黑)2021-018。小鼠饲养于恒温、恒湿、12 h明暗交替光照循环的SPF 级动物室，允许其自由饮水与饮食。本研究已经通过佳木斯大学基础医学院生物与医学伦理委员会的审查(批文号202311-2)。

1.1.3 动物造模适应性饲养2周后，采用随机数字法将小鼠分为空白组、模型组和干预组，每组8 只。模型组与干预组小鼠在实验第1～5 天每天腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg(溶于生理盐水)，空白组注射等体积生理盐水[7]。干预组小鼠自实验第6 天开始连续28 d每天灌胃给予齐墩果酸25 mg/kg(用2%的Tween 80配成混悬液)，空白组与模型组小鼠给予相应体积的2%Tween 80。

1.1.4 骨髓B淋巴细胞亚群测定在第35天，通过二氧化碳麻醉处死所有小鼠。分离股骨，用1 mL 无菌注射器吸取RPMI-1640培养液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，并通过200 目细胞滤网过滤。细胞悬液经300 g 离心5 min 后重悬于1 mL RPMI-1640 培养液中，再加入3 mL 红细胞裂解液冰上裂解15 min，300 g离心10 min后将细胞重悬于400 μL染色缓冲液中。计数后，将细胞浓度调整至1×105个/mL。向细胞悬液中加入抗体Anti-CD45R(B220)-APC(稀释20倍)与Anti-IgD-PE(稀释20倍)，室温避光孵育25 min。染色缓冲液清洗细胞，上流式细胞仪检测，使用FlowJo X 10.0.7r2软件对实验数据进行分析。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 数据库筛选靶点从PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取齐墩果酸的化学结构，用SwissTargetPrediction 数据库(http://swisstargetprediction.ch/)预测齐墩果酸的药物靶点。选择可能性值(probability)＞0.1的靶点作为齐墩果酸的潜在药物靶点。

1.2.2 蛋白质相互作用网络分析与富集分析用String平台(https://www.string-db.org/)对潜在的药物靶点进行蛋白质相互作用网络分析、GO 生物过程分析和KEGG 信号通路富集分析，用Cytoscape 3.6.0 软件对蛋白质相互作用网络分析结果进行可视化并计算连通性(degree)，用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)对GO 生物过程富集分析和KEGG 信号通路富集分析的结果进行可视化。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 齐墩果酸对免疫抑制小鼠骨髓B淋巴细胞亚群的作用

流式细胞术检测结果显示，在给药4 周后，模型组小鼠的成熟B细胞亚群(IgD与B220双阳性细胞)百分率为(2.585±0.248)%，明显低于空白组(8.235±0.361)%，差异具有统计学意义(P＜0.01)；干预组小鼠的成熟B细胞亚群百分率为(3.395±0.445)%，明显高于模型组而低于空白组，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，见图1。

图1 齐墩果酸对免疫抑制小鼠骨髓B淋巴细胞亚群作用的代表性流式结果散点图

2.2 齐墩果酸的潜在药物靶点

通过SwissTargetPrediction 数据库共检索到100 个预测的齐墩果酸药物靶点。以上靶点的可能性的中位数为0.100，因此以0.100 为阈值筛选潜在的药物靶点。共发现76个药物靶点大于阈值，其中可能性排位较高的前15个药物靶点见表1。

表1 齐墩果酸可能性排名前15位的靶点列表

2.3 齐墩果酸药物靶点相互作用网络的枢纽观察

经String 平台分析，发现输入的76 个药物靶点涉及到292种相互作用。Cytoscape 计算绘图后，得到71个节点。Cytoscape计算蛋白质相互作用网络发现蛋白间连通性均值为8.225。连通性排名前5的节点蛋白有PPARG、PTGS2、PPARA、MAPK3 和HMGCR，表明它们在蛋白质相互作用网络中起着重要枢纽作用，见图2。

2.4 齐墩果酸药物靶点的富集分析

通过GO 生物过程富集分析，发现齐墩果酸的药物靶点在多个生物过程中富集，其中包括突触传递的负调控、有丝分裂细胞周期停滞、脂质储存的负调控、前列腺素的分泌、干扰素-γ信号通路的负调控及正调控B 细胞受体(B cell receptor，BCR)信号通路等。根据富集因子对这些生物过程进行了排序，排名前30 的生物过程见图3。此外，在KEGG 信号通路分析中，齐墩果酸的药物靶点被富集于29条不同的信号通路，其中包括PPAR 信号通路、花生四烯酸代谢通路、脂肪消化吸收通路、脂肪细胞中脂质分解的调控以及BCR信号通路等，见图4。

图3 齐墩果酸靶点的GO生物过程富集分析结果

图4 齐墩果酸靶点的KEGG信号通路富集分析结果

3 讨 论

齐墩果酸是天然产物有效成分领域的研究热点，具有广泛且复杂的生物学效应。齐墩果酸能够调控Bcl-2 蛋白、HIF-1α、p21、p53 等蛋白质的表达水平，还能干预NF-κB、PI3K/Akt/mTOR 等信号通路，从而对细胞生长、凋亡、代谢等各个方面产生深远影响[8]。在本研究中我们发现，在第35 天，模型组动物的骨髓成熟B 细胞亚群明显低于空白组动物，说明免疫抑制动物模型成功建立；干预组动物的成熟B 细胞亚群百分率明显高于模型组动物，说明齐墩果酸能有效促进免疫抑制动物B 淋巴细胞的发育与分化，显示出其对B 淋巴细胞损伤的保护作用。为了阐明齐墩果酸的作用机制，本研究通过网络药理学方法，发现齐墩果酸的作用包括PTPN1、POLB、AKR1B10 和PTPN2 等诸多靶点。蛋白质相互作用网络分析发现，在齐墩果酸的药物靶点中PPARG、PTGS2、PPARA、MAPK3和HMGCR 在相互作用网络中扮演着重要的枢纽角色。在过去的研究中，齐墩果酸被发现能调节PPARG 与PPARA 的表达，其作用可能与齐墩果酸降血糖效应有关[9]。在其他研究中，齐墩果酸及其衍生物被发现能够通过抑制PTGS2的蛋白活性及表达水平抑制诱导型一氧化氮合酶的激活，从而诱导肿瘤细胞凋亡[8]。以上的证据表明，本研究中预测的药物靶点确实与齐墩果酸的药理作用密切相关。

在进一步的GO 生物过程富集分析和KEGG 信号通路分析中，本研究发现齐墩果酸的药物靶点富集于肝功能密切相关的生物过程与信号通路，如脂质储存的负调控以及脂肪细胞中脂质分解的调控等。另外，BCR 信号通路是GO 生物过程富集分析和KEGG 信号通路分析共同富集到的结果。BCR 信号通路在B 淋巴细胞的骨髓发育及离开骨髓后的分化过程中扮演着重要的角色[10]。基于先前在动物实验中所获得的结果，我们认为齐墩果酸可能是通过调控BCR信号通路影响了B 淋巴细胞的发育过程。在GO 生物过程富集分析和KEGG 信号通路分析中，药物靶点MAPK3、CD81等被富集于BCR信号通路。CD81在B细胞的生理功能中扮演着重要的角色。CD81 是将CD19 从细胞内部运输到细胞表面必不可少的因子，并且和CD19、CD21分子组成B细胞共受体复合物，从而降低了BCR激活的门槛，其纯合致残突变会导致人免疫缺陷综合征的发生[11]。与其作用相似，MAPK3 能够通过影响支持B淋巴细胞存活的BCR信号维持成熟B淋巴细胞亚群的数量稳定[12]。值得注意的是，在我们的结果中，MAPK3 是蛋白质相互作用网络的枢纽节点之一，而CD81 在齐墩果酸的靶点预测中排名靠前。因此，MAPK3 与CD81 可能是齐墩果酸影响BCR 信号通路的直接药物靶点。

总之，本研究利用网络药理学的方法初步分析了齐墩果酸对体液免疫的调节作用和其作用机制。结果提示，齐墩果酸具有提高体液免疫力的药效学功能，能够提高骨髓中成熟B 淋巴细胞亚群的比例。齐墩果酸可能是通过作用于MAPK3与CD81来影响BCR信号通路，从而在B 淋巴细胞的发育过程中发挥关键作用。在之后的工作中，本研究团队将继续对齐墩果酸的免疫调节作用进行深入研究，以期实现从基础研究向临床应用的转化。