PGAM5在胰腺癌中的表达及其与临床病理指标的关系

薛 松，胡加海，董祥宁

(安徽医科大学附属滁州医院/滁州市第一人民医院肿瘤内二科，安徽 滁州 239001)

胰腺癌具有临床表现隐匿、发展迅速和预后差的特点，总体发病率和死亡率逐年上升。2020 年GLOBOCAN 数据显示，全球胰腺癌新发病例约49.6万，新增死亡病例约46.6 万[1]。胰腺癌的早期症状不典型，多数患者确诊时已经处于晚期，5 年总生存(overall survival，OS)率不足10%。晚期胰腺癌的治疗以化疗为主，目前国际公认的一线化疗方案包括：白蛋白结合型紫杉醇+吉西他滨、奥沙利铂+伊立替康+5-氟尿嘧啶/亚叶酸[2]。但化疗疗效有限且耐药难以避免，胰腺癌的治疗亟需新突破。免疫治疗在近年来取得了显著的进展，但在晚期胰腺癌领域效果甚微[3]。在靶向治疗药物方面，PARP抑制剂、KRAS抑制剂等取得了一定的效果，但限于突变频率较低，受益患者较少[4]。因此，寻找新的治疗靶点对改善晚期胰腺癌患者的预后有重要意义。

磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase family member，PGAM)是糖酵解和糖异生的重要酶，催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸[5]。PGAM5是PGAM 家族成员之一，但其催化磷酸组氨酸特征基序的保守性较差，因此缺乏变位酶活性[6]。尽管如此，PGAM5 通过蛋白质-蛋白质相互作用及其特定的Ser/Thr/His蛋白磷酸酶活性参与线粒体动力学和凋亡的调节[7]。cBioPortal 数据库显示，PGAM5突变发生在多种肿瘤中，突变位点主要集中在PGAM 结构域。这些突变可能会改变PGAM5 在线粒体动力学和程序性细胞死亡中的作用，并促进肿瘤的发展。PGAM5已被证实在多种恶性肿瘤中过表达[8-10]，但目前其在胰腺癌中是否异常表达尚无报告。本研究旨在明确PGAM5 在胰腺癌组织中的表达及其与患者临床病理指标的关系。

1 材料与方法

1.1 生物信息学数据分析

从UCSC Xena官网(https://xenabrowser.net/datapages/)下载癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中胰腺癌的RNA-seq 数据和基因型组织表达(Genotype-Tissue Expression，GTEx)中正常组织的RNA-seq 数据。纳入研究的TCGA 数据集包含179 个胰腺癌组织样本和4个癌旁正常组织样本；GTEx数据集包含167 个正常组织样本。利用ggplot2 软件包(V3.3.6)分析PGAM5 mRNA 在胰腺癌组织和正常组织中的表达差异。

1.2 临床标本收集、PGAM5 蛋白表达检测及相关分析

1.2.1 标本收集及患者临床特征收集了2018 年01月—2020年12月于滁州市第一人民医院就诊的胰腺癌患者临床资料86 例(52 例包含肿瘤组织标本及其对应的癌旁正常组织标本)。其中男性50 例(58.1%)，女性36 例(41.9%)；年龄＜60 岁53 例(61.6%)，≥60 岁33 例(38.4%)。根据AJCC 第8 版TNM 分期标准进行分期，其中I～II期28例(32.6%)，III～IV期58例(67.4%)；肿瘤长径≤4 cm 者28 例(32.6%)，＞4 cm 者58 例(67.4%)；无淋巴结转移15 例(17.4%)，有淋巴结转移71 例(82.6%)；无远处转移60 例(69.8%)，有远处转移26 例(30.2%)。纳入标准：①经病理学检查诊断为胰腺癌；②有保存良好的组织标本；③有详细临床病理资料和随访信息。排除标准：合并有其他肿瘤及重要器官功能障碍者。采用门诊、电话或网络通信相结合的方式进行随访。所有患者在首次就诊后开始随访，每月随访1 次，随访时间截至2023 年07 月31 日，随访率100%。生存期(overall survival，OS)为从病理学诊断为胰腺癌到患者死亡或随访截止时间。此外，通过手术收集6 对新鲜胰腺癌组织及其癌旁正常组织标本。本研究经安徽医科大学生物医学伦理委员会批准(批准文号为83220465)。

1.2.2 主要试剂过氧化氢、PBS缓冲液、TBST缓冲液、牛血清白蛋白均购自国药集团化学试剂有限公司；DAB 染色液、苏木素染色液、EDTA 抗原修复液、PMSF 蛋白酶抑制剂、RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、PVDF 膜、ECL 化学发光试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)均购自碧云天生物技术有限公司；兔来源PGAM5 抗体和GAPDH 抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2.3 Western blot6 对新鲜胰腺癌组织及其癌旁正常组织标本采用Western blot 检测PGAM5 蛋白的表达水平。首先冰浴上取出新鲜胰腺癌组织及其癌旁正常组织，PBS 洗涤并剪碎，加入含PMSF 蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰浴超声匀浆。冰浴静置30 min，4 ℃离心20 min，取上清，取少量用BCA法测定蛋白质含量，其余转入-80 ℃保存备用。50 μg蛋白样品经SDS-PAGE 凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上，放入含5%脱脂牛奶的TBST 中，室温封闭2 h。滴加PGAM5 一抗(1∶20 000 倍稀释)，4 ℃轻摇过夜。TBST洗涤后滴加二抗(1∶1 000倍稀释)，室温轻摇孵育2 h。通过ECL 化学发光试剂检测免疫反应条带。

1.2.4 免疫组织化学染色采用免疫组织化学染色(immunohistochemical staining，IHC)检测胰腺癌组织中PGAM5 蛋白的表达水平。常规石蜡包埋，脱蜡至水，加入EDTA 抗原修复缓冲液，并于微波炉内进行抗原修复。3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，血清封闭20 min 后滴加PGAM5 一抗(1∶200 倍稀释)，4 ℃过夜。PBS 洗涤后滴加二抗(1∶50 倍稀释)，室温作用50 min。PBS洗涤后进行DAB显色，苏木素对比染色。脱水封片，显微镜镜检，图像采集分析。

DAB 显出的阳性表达为棕黄色，苏木素染细胞核为蓝色。结果以阳性细胞百分率和染色强度结合综合计分。阳性细胞比例评分标准：≤5%为0分，＞5%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分。染色强度评分标准：无染色为0 分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两者分数相乘，评分的中位值(6 分)为界，总分≥6 分判定为高表达，＜6分判定为低表达。染色结果由2名病理医师独立双盲判断。

1.3 统计学方法

生物信息学数据应用R 4.2.1 软件进行整理和统计学分析，利用Mann-WhitneyU检验比较PGAM5 在胰腺癌组织和正常组织中的表达差异。临床数据应用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，计量资料用表示，计数资料用百分比(%)表示；采用Wilcoxon符号秩检验比较PGAM5 在配对样本间的表达差异；卡方检验分析PGAM5 与临床病理特征的关系；Spearman 相关系数分析二元变量间的相关性；Cox 回归模型进行单因素或多因素分析。应用GraphPad Prism 9.4.0 软件绘制Kaplan-Meier 生存曲线。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PGAM5在胰腺癌组织中的表达水平

TCGA 和GTEx 数据库分析表明，胰腺癌组织中PGAM5 mRNA的相对表达量(4.04±0.50)高于正常组织(2.93±0.52)，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见图1。Western blot 检测结果显示在6 对新鲜胰腺癌组织中PGAM5蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织，提示PGAM5蛋白的表达水平在胰腺癌组织中表达上调，见图2。IHC 检测结果显示，PGAM5 蛋白在胰腺癌组织中呈棕黄色颗粒状，主要在细胞胞浆中表达(图3A)。IHC半定量分析显示，52例胰腺癌组织PGAM5蛋白表达的中位评分为6分(5.27±3.31)，对应的癌旁正常组织PGAM5 中位评分为2 分(2.65±2.12)，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见图3B。

图1 生物信息学分析PGAM5 mRNA在胰腺癌组织中的表达水平

图2 Western blot 检测PGAM5蛋白在6对新鲜胰腺癌组织和对应癌旁正常组织中的表达

2.2 PGAM5与胰腺癌患者临床病理指标的关系

在86例胰腺癌组织中，PGAM5高表达者占53.5%(46/86)，PGAM5 低表达占46.5%(40/86)，分析其表达水平与胰腺癌患者临床病理指标的相关性。如表1 所示，PGAM5 的表达水平与胰腺癌患者TNM 分期、肿瘤长径和远处转移有关(均为P＜0.01)，与年龄、性别和淋巴结转移无明显相关(P＞0.05)。Spearman 相关分析表明，PGAM5 与TNM 分期、肿瘤长径、淋巴结转移和远处转移有关，与年龄和性别无明显相关(P＞0.05)，见表2。

表1 PGAM5表达水平与临床病理指标之间的关系

表2 PGAM5表达水平与临床病理指标的相关性分析

2.3 PGAM5对胰腺癌的生存预后价值

采用Cox 回归模型分析PGAM5 表达与86 例胰腺癌患者生存预后的相关性。单因素分析提示，PGAM5、TNM分期、淋巴结转移和远处转移均是影响胰腺癌患者预后的危险因素(P＜0.01)；而年龄、性别、肿瘤长径与患者预后无关(P＞0.05)。将单因素分析中有统计学意义的变量纳入多因素分析模型，结果发现，PGAM5蛋白的表达水平是胰腺癌患者生存预后的独立影响因素[HR=2.101，95%CI(1.210，3.646)，P=0.008]，见表3。Kaplan-Meier 生存曲线显示，PGAM5低表达组患者的中位OS为27个月，而PGAM5高表达患者的中位OS 仅为17 个月，差异有统计学意义[HR=2.470，95%CI(1.533，3.980)，P＜0.01]，见图4。

表3 86例胰腺癌患者OS的单因素和多因素分析

图4 86例胰腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

线粒体是细胞增殖过程中平衡氧化应激和细胞死亡的重要细胞器，多项研究证实PGAM5 是线粒体动力学和细胞凋亡的关键调节因子[7]。了解细胞如何防御线粒体应激以避免细胞凋亡的过程对于开发有效的疾病治疗方法至关重要。在轻度应激下，PGAM5调节线粒体生物发生和线粒体自噬，维持线粒体稳态，促进细胞存活[11]。在严重应激下，PGAM5促进线粒体分裂，整合多种死亡信号诱导细胞死亡[12]。已有研究表明，PGAM5的异常表达与人类多种疾病密切相关。与健康人群相比，帕金森病患者血浆中PAMG5 水平明显升高，且具有较高的敏感性和特异性，PGAM5可能是诊断帕金森病的生物标志物[13]。在免疫反应方面，PGAM5可抑制NDPK-B介导的组氨酸磷酸化，激活K+通道KCa3.1，并负性调节CD4+T细胞[14]。敲除或抑制PGAM5 可通过抑制Drp1 减少心肌细胞坏死，并改善大鼠的心肌缺血再灌注损伤。抑制Ripk3-PGAM5-CypD-mPTP通路可减轻心脏微血管缺血再灌注损伤[15]。

线粒体功能障碍是肿瘤细胞的一个显著特征。PGAM5的异常表达可导致线粒体超微结构异常和线粒体功能障碍，现已发现与多种肿瘤相关。肝癌组织中PGAM5 的表达高于正常组织，PGAM5 通过与Bcl-xL和Keap1 的相互作用介导肝癌的化疗耐药[8]。Kwong等[9]已证实PGAM5在非小细胞肺癌和癌前组织(鳞状不典型增生和原位癌)中表达，但在正常上皮中不表达。此外，PGAM5 在胃癌组织中高表达并通过PI3K/AKT信号通路调节胃癌细胞的生长和侵袭[10]。在结直肠癌组织中，PGAM5 和Parkin 蛋白的表达也明显升高[16]。然而，也有研究报道在人结直肠癌中，PGAM5 和Bcl-xL 的表达低于正常组织，而Keap1 的表达高于正常组织，Keap1介导的PGAM5和Bcl-xL降解可能在结直肠癌中较为活跃[17]。迄今为止，PGAM5在胰腺癌中的表达、与患者临床病理特征之间关系的研究甚少，值得进一步探索。

本研究通过分析TCGA和GTEx数据库中胰腺癌和正常组织的RNA-seq 数据，结果显示PGAM5 在胰腺癌组织中明显过表达。随后利用Western blot 和IHC验证了生物信息学分析结果，Western blot 分析显示PGAM5 在胰腺癌组织中的表达明显高于正常组织。IHC 结果显示，肿瘤组织中PGAM5 的高表达率为53.5%(46/86)；相比之下，在癌旁正常组织中的高表达率仅为13.5%(7/52)，表明PGAM5 在胰腺癌中的表达水平显著升高。这些结果表明，PGAM5可作为鉴别胰腺组织良性和恶性的标记物。进一步将PGAM5 的IHC 评分与胰腺癌患者的临床病理数据进行了关联分析。相关性分析提示PGAM5 表达水平与TNM 分期、肿瘤长径、淋巴结转移和远处转移相关，而与年龄、性别无关。多因素分析发现PGAM5、淋巴结转移和远处转移是影响胰腺癌患者生存预后的独立危险因素(P＜0.01)。Kaplan-Merier 生存分析表明，PGAM5 高表达的胰腺癌患者中位OS 仅为17 个月，明显低于PGAM5 低表达患者中位OS 的27 个月(P＜0.01)。这些结果提示，PGAM5可能是判断胰腺癌患者预后的重要分子标志。

综上，PGAM5可能是胰腺癌预后判断的潜在生物学标志物，其表达水平与胰腺癌患者临床病理特征密切相关，PGAM5 高表达提示预后较差。因此，对于PGAM5高表达的胰腺癌患者，建议强化术后辅助治疗方案，如患者一般状况良好，可考虑奥沙利铂+伊立替康+5-氟尿嘧啶/亚叶酸三药方案作为术后辅助化疗方案[18]。此外，本研究为回顾性研究，且样本量较少，可能存在选择偏倚，需要更加严格的大样本、多中心研究来进一步验证。对于PGAM5 在胰腺癌发生、发展中的作用机制，还需要进一步的深入研究。