超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定化妆品中8种替丁类禁用药物

张秋炎，梁维维，罗辉泰，廖均涛，黄 芳，吴惠勤

（广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070）

化妆品产业高质量发展的同时，其安全问题也日益引起消费者的重视。药物非法添加行为屡禁不止，给消费者的使用带来潜在风险［1］。以西咪替丁、雷尼替丁为代表的替丁类药物是组胺H2受体拮抗剂，能有效降低胃酸，多用于治疗消化性溃疡，如十二指肠溃疡和胃溃疡等。此外，替丁类药物具有阻断双氢睾酮与受体结合的作用，可抑制皮脂分泌，故常单独或联合应用治疗带状疱疹、荨麻疹、过敏性紫癜、湿疹、痤疮等皮肤病［2-3］。西咪替丁已被国家药品监督管理局列为化妆品中主要检测物质之一，并公布了其检测方法，但该方法仅对西咪替丁进行分析，并未针对其他替丁类药物［4］。不法企业为了规避政府监管，可能添加与西咪替丁功能相似的其他替丁类药物替代西咪替丁。常见替丁类药物包括雷尼替丁、罗沙替丁等8种，化学结构式如图1所示。目前针对化妆品中替丁类药物的测定方法主要有液相色谱法［5-6］、液相色谱-质谱联用法［7-9］等，但上述方法涉及的替丁类化合物最多仅3 种，未包括常见的替丁类药物。因此，建立涵盖种类更齐全的替丁类化合物检测方法尤为迫切，对保障化妆品质量安全具有重要的现实意义。

图1 8种替丁类药物的化学结构式Fig.1 Chemical structures of eight tidine drugs

本文首次建立了可同时测定5种不同类型化妆品基质（包括水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类）中8 种替丁类药物的超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）。本方法简单高效、易操作、灵敏度高、可行性强，目前已成功应用于分析检测工作中。本法可作为政府部门有效的技术支持和补充方案，为化妆品中非法添加药物监测提供科学依据，便于化妆品市场的监管。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290 Ⅱ UHPLC/6470A Triple Quard MS超高效液相色谱/串联四极杆质谱联用仪（美国Agilent公司）；AS 3120 超声波发生器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；TP-114 电子天平（美国Sartorious 公司）；XW-80A 快速混匀器（海门市麒麟医用仪器厂）；1850R 高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；YMC-Triart C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.0 μm，日本株式会社YMC）。

乙酸、甲酸、乙酸铵及甲酸铵为LC-MS 级（美国Sigma 公司）；乙腈（ACN）及甲醇（MeOH）为LCMS级（德国Merck公司）；实验用水为二次蒸馏水，其余所用试剂为分析纯。

8 种对照品：西咪替丁（纯度99.8%）、雷尼替丁（纯度99.9%）、法莫替丁（纯度99.5%）、尼扎替丁（纯度99.6%）、拉呋替丁（纯度99.8%）及盐酸罗沙替丁醋酸酯（纯度100%）购于中国食品药品检定研究院；乙溴替丁及硫替丁（质量浓度100 μg/mL）购于天津阿尔塔科技有限公司。所用化妆品样品来源于市场购买或客户委托送检。

1.2 标准溶液配制

分别称取西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁、拉呋替丁、盐酸罗沙替丁醋酸酯约10.0 mg至10 mL容量瓶中，以甲醇作为溶剂超声定容至刻度，制得质量浓度约为1 000 μg/mL的单标标准储备液，转移至棕色储液瓶中，4 ℃保存。另分别量取乙溴替丁和硫替丁各1 mL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，涡旋均匀得到10 μg/mL的单标标准储备液，转移至棕色储液瓶中，4 ℃保存。

1.3 样品处理

称取样品约0.2 g（精确至0.01 g）于10 mL具塞比色管中，加入2 mL水，在旋涡混合器上高速振荡30 s 后用乙腈定容至刻度，涡旋振荡1 min 后超声提取15 min，待提取液静置至室温，4 000 r/min 下离心10 min。取上清液经0.22 μm滤膜过滤，滤液上机分析。必要时用适量80%乙腈稀释。

1.4 仪器测定条件

1.4.1 液相色谱条件色谱柱：YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）；流动相：A相为0.2%（体积分数，下同）甲酸溶液，B 相为乙腈；流速：0.35 mL/min；梯度洗脱程序：0~1.00 min，5% B；1.00~6.00 min，5%~20% B，6.00~9.00 min，20%~65% B；9.00~9.01 min，65%~95% B；9.01~10.50 min，95% B；10.50~10.51 min，95%~5% B；10.51~12.00 min，5% B。进样量：0.5 μL；柱温：30 ℃；分析时间：12.0 min。

1.4.2 质谱条件用喷射流电喷雾离子源（AJS ESI）在正离子模式下检测；采集方式为多反应监测（MRM）；干燥气流速为10 L/min；干燥气温度为325 ℃；鞘气流速为11 L/min；鞘气温度为350 ℃；雾化气压力为310 kPa；毛细管入口端电压为4 000 V；喷嘴电压为500 V。8 种替丁类药物的化合物信息及质谱采集参数见表1。

表1 8种替丁类药物的分子式、CAS号、保留时间及质谱采集参数Table 1 Molecular formula，CAS registration number（CAS No.） ，retention time and MS parameters of eight tidine drugs

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别配制1 mg/L 的8 种替丁类药物单标标准溶液，在正、负离子模式下进行一级全扫描分析，发现8 种替丁类药物在［M+H］+加合方式下响应最高。原因可能是8 种替丁类药物均为含氮化合物，氮原子的孤对电子易接受质子，形成［M+H］+的准分子离子峰。选择仪器自带的Optimizer软件对各化合物的特征子离子、碰撞能量和碎裂电压等质谱参数进行优化以达到欧盟2002/657/EC 关于4 个识别点的要求［10］。8种替丁类药物的质谱采集参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择比较了5 种不同型号色谱柱YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）（A）、ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）（B）、ZORBAX SB-C8RRHD（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）（C）、Poroshell 120 PFP（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）（D）和CORTECS UPLC@T3（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）（E）的分离效果。结果表明：8 种替丁类药物在D 柱上的保留差，出峰较早，分离效果较差；C 柱上雷尼替丁和尼扎替丁存在色谱峰过宽或分叉等情况；8 种替丁类药物在A 柱、B 柱和E柱上有较好的保留，且分离效果理想，雷尼替丁和尼扎替丁的峰形均无拖尾现象，其他6 种替丁类药物的峰形良好；此外8种替丁类药物在A 柱上的响应最高，B 柱次之。综合比较，最终选择A 柱YMCTriart C18（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）作为色谱分离柱。

2.2.2 流动相的选择流动相不仅会直接影响目标物的峰形，还会对目标物的保留行为产生影响，此外流动相也是影响质谱灵敏度的因素之一。在选定的色谱柱上，以乙腈为有机相，比较了盐类缓冲体系（5 mmol/L 乙酸铵溶液、5 mmol/L 甲酸铵溶液）、5 mmol/L 乙酸铵溶液（含0.2%甲酸溶液）、5 mmol/L甲酸铵溶液（含0.2%甲酸溶液）、0.2%甲酸溶液和0.2%乙酸溶液6种水相对8种替丁类药物的分离情况。结果显示，雷尼替丁、法莫替丁及硫替丁的峰形可能是受铵盐影响，在盐类缓冲体系下存在色谱峰过宽或分叉等情况；盐类缓冲体系中添加0.2%甲酸后，法莫替丁及硫替丁的峰形得到改善，但雷尼替丁的峰形无明显改善，原因可能是替丁类化合物结构中N 原子上的孤电子对能接受质子，对流动相pH 值较敏感，其中以雷尼替丁最为明显；0.2%甲酸溶液和0.2%乙酸溶液两种水相体系下，雷尼替丁的峰形均得到改善，相对而言，0.2%甲酸溶液体系下雷尼替丁的峰形更尖更窄，推测是因为甲酸的酸性比乙酸强所致。经反复实验，以0.2%甲酸溶液为水相，乙腈为有机相，采用梯度洗脱，8 种替丁类药物可获得较佳分离效果且保留时间分布均匀，色谱峰无拖尾，质谱灵敏度良好。综合考虑，最终确定的色谱分离条件如“1.4.1”所示。在该条件下，8种替丁类药物的色谱峰形良好，色谱保留适中且灵敏度高（见图2）。

图2 8种替丁类药物混合标准溶液的提取离子色谱图Fig.2 MRM chromatograms of mixed standard solution of eight tidine drugs

2.3 样品前处理条件的优化

本实验前处理条件的优化主要在于提取溶剂的选择。待测化合物极性和样品基质类型决定了提取溶剂的选择［11］。实验涉及的8种替丁类药物结构和性质相近，易溶于甲醇和乙腈等；化妆品基质复杂，不同基质类型的化妆品适用的提取溶剂也不尽相同，通用型提取溶剂主要有甲醇和乙腈等。以乙腈作为提取溶剂时，膏霜类等复杂基质样品不易分散，而用少量水分散后再加入乙腈则具有更好的润湿性，增加了提取溶剂的渗透性，同时也使基质分散更均匀，对大部分化合物的提取效果更好［12］。此外，超声波辅助提取广泛用于化妆品的样品前处理，水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类等绝大多数化妆品样品均可用该法进行前处理［13-14］。在此基础上，以5 种不同类型化妆品（包括水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类）为样品基质，分别比较了甲醇和水-乙腈（2∶8，体积比）作为溶剂，超声波辅助提取时，各替丁类化合物的回收率（见图3）。结果显示，采用两种提取溶剂超声提取15 min 条件下，8 种替丁类药物的回收率相差不大，回收率均较高。考虑到乙腈沉淀大分子杂质（如硅油、蜡质等）、增溶剂（如色素及蓖麻油等）等的效果优于甲醇，基于对仪器、色谱柱等的保护，选用水-乙腈（2∶8）作为提取溶剂。

图3 提取溶剂对8种替丁类药物回收率的影响Fig.3 Effect of extraction solvents on recoveries of eight tidine drugs

2.4 基质效应评价

基质效应是液相色谱-质谱分析过程中不可忽略的关键因素，不仅直接影响方法的灵敏度，还影响方法的准确度和精密度。基质效应通常采用公式ME=B/A进行计算，其中B为空白基质溶液作为溶剂配制的标准曲线的斜率，A为纯溶剂配制的标准曲线的斜率［15］；ME值越接近100%，表明基质效应越可忽略不计。5种不同类型化妆品基质（包括水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类）中8种替丁类药物的基质效应见表2。结果表明，乙溴替丁在大多数基质中存在一定的基质效应，硫替丁在水剂类基质中也存在一定的基质效应。减少基质效应的方法通常包括增加净化步骤、稀释样品溶液、配制空白基质匹配标准溶液、采用同位素内标物校正以及优化色谱-质谱条件等［16］。为保证定量结果的准确性，综合考虑成本、操作方便性，本文选择基质匹配标准溶液法降低基质效应的影响。

表2 8种替丁类药物的线性关系、检出限、定量下限和基质效应Table 2 Linear relationship，LODs，LOQs and matrix effects of eight tidine drugs

2.5 线性范围、检出限与定量下限

用空白基质提取液将8 种替丁类药物稀释成系列混合标准溶液，按“1.4”的仪器条件进行测定，以各替丁类药物的质量浓度为横坐标（x，μg/L），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归分析。8种替丁类药物均获得良好的线性关系，相关系数（r2）为0.997 5~0.998 6。采用标准添加法确定各替丁类药物的检出限（S/N≥3）和定量下限（S/N≥10）分别为0.06~0.3 μg/L和0.2~1.0 μg/L（见表2）。

2.6 回收率与相对标准偏差

准确称取空白水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类基质化妆品各0.2 g，进行3 个加标水平的回收实验，每个水平按“1.3”和“1.4”方法平行测定6 次，计算各替丁类药物的平均回收率和相对标准偏差（RSD，n=6）。由表3可见，水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类基质的平均回收率分别为80.7%~106%、90.1%~102%、82.6%~101%、82.0%~110%和86.6%~101%，均在80%~115%之间；RSD 分别为0.70%~7.0%、1.0%~5.7%、2.1%~6.9%、0.90%~7.4%和1.7%~ 7.9%，均小于10%。结果表明，本方法的准确度和精密度良好，适用于5种基质化妆品中8种替丁类药物的检测。

表3 8种替丁类药物在不同基质中的平均回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations（RSDs） of eight tidine drugs in different matrixes（n=6）

2.7 稳定性

分别在空白水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类基质化妆品中添加低、中、高3个水平的8种替丁类药物，同一日内连续6 次（0、5、10、15、20、24 h）测定，以峰面积计算8 种替丁类药物在5种基质中的RSD。结果表明，5 种不同空白基质中，8 种替丁类药物在3 个添加水平下的RSD 分别为1.2%～9.0%、0.80%～7.3%和1.1%～6.7%，本方法具有较好的稳定性。

2.8 实际样品测定

采用本文所建方法对客户委托送检的100批次化妆品进行分析，在某款祛痘凝胶中检出西咪替丁，含量为28.2 μg/g。该阳性样品的总离子流图及西咪替丁的MRM色谱图见图4。

图4 阳性样品的总离子流图（A）及西咪替丁的MRM色谱图（B、C）Fig.4 TIC chromatogram（A） and MRM chromatograms（B，C） of cimetidine in a positive sample

3 结 论

本研究建立了同时快速测定5种不同类型化妆品基质（包括水剂类、膏霜类、乳液类、凝胶类和粉剂类）中8 种替丁类药物的UHPLC-MS/MS 法。方法前处理简单方便、灵敏度高、可行性强，可用于多种基质类型化妆品中替丁类药物的检测。该方法可作为政府部门有效的技术支持和补充方案，为监测化妆品中非法添加药物提供科学依据，便于化妆品市场的监管。