基于代谢组学方法的混合香精香料差异性物质鉴定与品质分析

冷 月，胡 芸，张 进，李博岩*，谢 锋，3*

（1.贵州医科大学 公共卫生与健康学院，环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵州 贵阳 550009；3.贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550000）

天然香精香料通常是多种结构相似的化学物质的混合物，具有独特的物理化学和感官反应性质，是食品、精油、化妆品、烟草等制造领域广为使用的添加剂［1-2］，其因在丰富产品种类、改善风味以及提升品质等方面均占据着重要的地位［3］而被称为 “液体黄金”。尤其是烟草领域，天然香精香料及其提取物因具有芳香浓郁、口感醇厚、危害性低的特点而成为烟用香精香料的主要来源［4-5］，对于增强卷烟香韵特征、改善卷烟吸味、突出品牌风格意义非凡。

目前已知的天然香精香料成分有四千多种，其生产已从自然植物资源中分离化学物质逐渐发展为以化学合成或生物过程为重要手段进行制备。香精香料物质组成复杂、风味各异，且基质多变，使其易受原料种类、地域来源、种植环境、贮存条件以及加工方法等诸多因素影响［6］，导致香精香料产品的多样性、易变性、调配掺假、批次间一致性欠缺等质量问题［7］。天然或混配的香精香料主要含有酯类、酮类、醇类、酸类、酚类等挥发性以及半挥发性物质。关于香精香料的研究较多，也开发有智能辅助调香系统，可以一定程度上调整配方、突出特定香气特点，但因研发成本高，调香技术不成熟，尚未普及。通常，单体香原料可以通过气相色谱-质谱（GC-MS）方法检测，但对于复杂的香精香料混合物，仅通过仪器难以准确定性其混合物。采用标准品与香料数据库相结合的指纹图谱方法可提高混合物的定性可靠性和定量准确性［8］，但仍存在不同香原料的全组分构成和香气特征信息缺乏的问题，使得香精香料配方研究、还原及复配、不同批次间的有效质量控制相当困难。

随着仪器技术的发展，新的分析策略被用于香精香料的解析。GC-MS 具有方法稳定、使用可靠、定量准确等特点，已成为多类风味物质分析的首选［9-11］；代谢组学方法具有高通量、广覆盖、数据整合、模式识别等优点，是众多复杂体系研究的强有力工具［12］。两者结合已成功用于挥发性及半挥发性复杂体系的感官预测、过程加工以及质量控制［13］。本文利用GC-MS 与代谢组学分析方法，对4种不同批次的混合香精香料样品进行组分鉴定和品质分析，明确样本的物质组成差异性、香气特征性以及品质一致性问题，助力混合香精香料的风味判断，为其复配、调香及安全生产提供了参考。

1 实验部分

1.1 试剂、仪器与材料

无水乙醇（≥99.5%，天津富宇精细化工有限公司）。Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司），Mill-Q超纯水净化系统（美国 Millipore公司），AE100梅特勒分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。某公司生产线上使用的不同批次，且具有不同风味特征的4种混合香精香料样品共93个，即A样品26个、B样品22个、C样品25个、D样品20个。

1.2 实验方法

1.2.1 GC-MS 检测称取1.000 g 香精香料样品，无水乙醇稀释至2.500 g，摇匀后取溶液用0.45 μm 微孔膜过滤，采用GC-MS 技术检测其挥发性成分［8］。色谱条件：色谱柱DB-5MS（60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）；载气 He；载气流速1.00 mL/min；进样量1.0 μL；进样口温度250 °C；分流比15∶1；分流流速15 mL/min。程序升温：50 °C 保持2 min 后，以8 °C/min 的速度升温至280 °C，保持25 min。质谱条件：全扫描，扫描范围为33~400 amu；离子源（EI）温度230 °C；电离电压70 eV；溶剂延迟4.80 min。

1.2.2 风味成分分析对各样本的GC-MS 数据进行谱峰识别、漂移校正、背景去除等处理，提取各色谱组分的质荷比、保留时间以及峰面积等特征信息。通过美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）质谱数据库检索，鉴定质谱相似度大于0.95 的化学物质［9］。去除不是风味添加剂的1，2-丙二醇、甘油和尼古丁［11］，计算各类香气组分的相对含量（即各组分的峰面积除以所有物质组分峰面积的总和）。利用《食用香料手册》［14］、http：//www.flavornet.org、https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov、http：//www. thegoodscentscompany. com 等数据库信息确定香精香料样本中风味成分的化学结构、名称和芳香性。

1.2.3 统计分析采用主成分分析（PCA）方法对校正色谱漂移后的样本特征图谱和由峰面积构成的峰表数据进行可视化分析，考察样本类型及批次之间的关联性及差异性；利用单位方差标度对数据进行标准化处理；通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进一步识别具有类别差异的挥发性物质。通过设置SIMCA14.1软件中7倍交叉验证方法和95%置信度建立PCA和PLS-DA评估模型，采用交叉验证方差分析（CV-ANOVA，p <0.01）和200 次置换检验进行模型验证。借助变量投影重要性分析值（VIP）及p<0.05 显著性水平筛选关键差异风味成分，使用SPSS 27.0 进行统计描述及单因素差异分析，基于https：//bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn平台绘制韦恩图。

2 结果与讨论

2.1 样品特征组分峰表

图1 给出了A、B、C、D 4 种香精香料样品原始GC-MS 特征图谱的总离子流图。可以看出，样品的化学组成复杂，含有几十种香气物质，除A类与C 类样本图谱在整体上具有较高的相似性及一致性外，不同类别样品间的图谱差异较大。

图1 4种样品的GC-MS特征图谱的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms（TICs） of GC-MS fingerprints of four samples

基于代谢组学数据分析方法［15-17］，对所有样本二维GC-MS 数据中的组分进行色谱峰校正和质谱信息特征提取，生成样品特征组分峰表，并通过NIST 质谱数据库检索，结果鉴定出93 种化合物。该峰表包含了每个样本所鉴定的各组成物质的名称、色谱保留时间、色谱峰面积、以及相对含量等，由于表格过大、内容过多，所以未在文中列出。其中，A 类样本主要包含49 种物质，B类样本中32 种物质，C 类样本中48 种物质，D 类样本中39 种物质。4 类样本的共有香气成分可分为8 种。根据官能团的结构不同，这些化合物分为：酯类、酮类、醇类、酸类、醛类、酚类、胺类及其他类物质。4 种香精香料样本的风味物质组成及比例不同，致香物质的种类和含量均存在一定的差异性，其中酯类化合物的数量最多（35 种），其次是酮类（16种）、醇类（12种）、酸类（12种）、醛类（9种）、酚类（3种）、胺类（2种）及其他类物质（4种），具体信息见表1。C 类和A 类样品中酯类风味物质的含量最丰富，分别为64.609%、38.568%。B类样品中酸类风味成分的相对含量最高（即42.812%）。D 类样品中含量最多的风味成分为酮类（44.763%）。乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、异戊酸异戊酯、麦芽酚、二丙二醇、乙酸、4-氧代戊酸及5-羟甲基-2-呋喃甲醛8种化合物为4种样本的共有香气成分（表2）。

表1 4种样本中挥发性风味物质的种类及相对含量（RC）Table 1 Types and relative contents（RC） of volatile flavor compounds in flavor and fragrance samples

表2 4种香精香料样品中共有成分的相对含量（RC）及风味特征Table 2 Relative content（RC） and flavor characteristics of compositions in common in samples（%）

2.2 风味成分分析

香气物质是评价香精香料样本品质的重要指标之一，因此对各样品中的风味成分进行分析鉴定。结果如表3所示。

表3 FEMA收录的天然香精香料风味特征的成分组群Table 3 Composition groups of flavor profile of natural flavors and fragrances included in FEMA

2.2.1 酯类化合物酯类致香物质具有柔和烟气、改善产品内在品质的作用以及来源广、香型多、价格适宜的特点，是应用最多的烟用香料，在总体香料中的占比≥20%。大部分酯类成分具有果香、花香及酒香等芳香性气味［18］。不同的酯类香精添加到卷烟中，使其具有不同的香型特征，导致了卷烟气溶胶中的风味差异。在A 类与B 类样本中共鉴定出14 种酯类物质，分别占总含量的38.568%和36.736%。二乙酸甘油酯是A类样本酯类物质中相对含量最多的物质，主要由1，2和1，3-二乙酸酯以及少量的单酯和三酯组成。乙酸乙酯在4 类样本中均有检出，在B 类样品中的含量尤为丰富，该物质主要提供白兰地酒香及葡萄果香。C类与D类样本中化合物的数量及相对含量差异较大。C类样本中22种酯类致香物质占了总体风味成分的64.609%，主要是菠萝果味的己酸烯丙酯、白兰地酒香的乙酸乙酯以及青草香的异戊酸异戊酯。D 类样本中13 种酯类化合物仅占总体风味物质19.067%，主要为具有奶酪香、花香、水果香的乳酸乙酯。

2.2.2 酮类化合物具有不饱和结构的羰基是致香基团，羰基化合物具有优美的香气，是烟气中的主要致香成分。该类香料物质主要用于强化香气风格特性，增加烟草甜香，使烟气和顺细腻。酮类化合物是样本中的第二大类风味物质，其种类及相对含量差异较大。A 类样品中10种酮类化合物占比为21.940%，C 类样品中7 种酮类物质占比约为17.050%，主要为2-羟基-3，5，5-三甲基环己-2-烯酮。B类样品中有5 种酮类化合物，仅占总含量的3.770%。D 类样本中酮类香料物质的相对含量最为丰富，占总含量的44.763%，主要来自致香物质3-甲基环戊烷-1，2-二酮及乙基麦芽酚。乙基麦芽酚是γ-吡喃酮的衍生物，具有果香风味，是较理想的香料物质，而且用量少、功效多、安全性高，可用于提升卷烟烟气回甜感、凸显卷烟“甜”与“润”的口感特征，是我国常用的香味增效剂，在4 类样品中均检出麦芽酚。

2.2.3 醇类及酸类化合物类似于酮类，醇类增香物质在卷烟中的作用是去除辛辣杂味、减少卷烟的刺激性。A 类样本中的反式-橙花叔醇具有木质香韵。D 类样品中的苯甲醇较为丰富，可为卷烟提供果香、烤面包香及玫瑰花香。然而，研究指出苯甲醇具有潜在吸入毒性风险［19］，会引起严重的眼睛刺激或皮肤刺激。甘油、丙二醇等低沸点多元醇在卷烟中既有保润作用，又能促进烟气及香气物质的释放，该类物质具有烟草毒性、成瘾性、致癌性等危害或风险。酸类致香物质可改善烟气酸碱度，使烟气吸味醇和，挥发性酸性致香物质在卷烟吸食过程中能够直接沁入烟气，对香味影响显著。B 类香精香料中酸类致香物质占总体风味成分的42.812%，主要来自乙酸及4-氧代戊酸，具有酸香及果香风味。该物质在A、C及D类样品中均有检出。

2.2.4 醛类、酚类及胺类化合物醛类物质一般具有青草味，可以改善口腔舒适度。A类和D类香料样本中含有少量苯甲醛，该物质提供苦杏仁、焦糖风味，可以减弱烟雾刺激，增加吸入量［9］。A类和C类样本中含有合成香料乙基香兰素，因其具有浓烈香子兰气息，并且香气清爽、纯正、用量少而被广泛应用于烟草调香，但会导致主流烟气中苯系物及酚类物质含量增加，危害人体健康。各类样本中的5-羟甲基-2-呋喃甲醛含量较为丰富，具有洋甘菊花香，该物质也存在于蜂蜜的挥发性成分中。酚类香精香料通常被用于增加烟草的芳香度和深度，提高香味格调。胺类物质可以增加烟草的甜味、果香味以及辛辣味。在B 类样本中未检出胺类致香物质，酚类物质只有2，4-二叔丁基苯酚。A 类、C 类及D类样本中酚类及胺类物质较少，主要是对甲氧基肉桂酚及2，2，3，3，3-五氟-N-（2-苯基乙基）丙酰胺。总体来说，样品中鉴定出的酚类及胺类的种类及相对含量均较少，其中大多对皮肤和眼睛有强烈刺激性，甚至存在神经毒素、肝毒素类物质，是影响卷烟安全性的重要因素。

作为必要辅料的香精香料，添加到烟丝中直接参与烟支燃烧，其化学成分的稳定性及生物安全性直接关系到卷烟的感官评价和消费者的健康安全。美国食品香料与萃取物制造者协会（Flavor and Extract Manufacturers Association，FEMA）基于食品用香料摄入量评估、代谢及遗传毒理学等数据研究，明确不同致香物质组群的风味特征和安全性用途，制作名录并赋予FEMA 编号。从卷烟调香的实际应用样本中共鉴定的93 种风味物质，37 种化合物具有FEMA 编号，表3 概括了这些物质的风味信息。未在名录上的56 种化合物，其生物安全性仍不确定，应是毒理学研究以及风味安全监管机构的关注重点，需对其进行加香卷烟烟气体外与吸入毒理学评价研究等。

2.3 差异物鉴定

2.3.1 基于峰面积的差异物分析应用PCA 方法可视化分析不同类型香精香料样本的风味化合物。3个主成分解释了峰表数据的95.90%的总方差，所得模型中代表拟合优度及预测能力的R2X和Q2的值分别为0.970和0.962，因此模型较为合理可靠。图2a给出了该PCA模型的得分图。从图中可以看出4类样本的风味物质存在显著差异，对应的得分分布明显不同，而同类型不同批次样本分布较为接近。该结果反映了样本数据特征组分的分布共性和差异性。借助PLS-DA 模型进一步挖掘样本组间的特征组分差异。模型中交叉验证参数R2X 为0.969，R2Y 为0.996，Q2为0.996，CV-ANOVA 和置换检验结果均较好，说明了PLS-DA模型的可靠性。图2b所示的香精香料样品的PLS-DA得分图与PCA的分析结果（图2a）一致。利用PLS-DA模型中衡量每个变量对各组样本分类判别的影响强度及解释能力的变异权重参数值（VIP）辅助筛选标志变量，判别依据一般认为VIP > 1.0表示该变量具有重要作用，VIP值越大说明该化合物在样本间的差异越显著。根据VIP > 1.0且p< 0.05的标准，从4类样本中共筛选出苯乙酮、苯甲酸乙酯、肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、糠醇、3-去氧-D-甘露醛酸、3-呋喃甲酸甲酯、苯乙酸、叔丁基酚、苹果酸二乙酯、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-羟基丙酸等40种差异性化合物。

图2 基于峰面积数据的香精香料样品的PCA（a）和PLS-DA（b）分析得分图Fig.2 PCA（a） and PLS-DA（b） score plots of flavor and fragrance samples based on the peak area data

2.3.2 基于总离子流图的差异特征分析运用多尺度谱峰匹配（MSPA）方法［20］对各样本GC-MS数据中的漂移色谱峰进行保留时间校准和谱峰匹配。以A 类和C 类中50 个样本（剔除1 个奇异样本）为例，图3L是其在8.867~9.405 min范围内的原始数据的总离子流（TIC）图。可以看出，不同样本的色谱峰存在明显的漂移现象。因此，有必要进行谱峰漂移校准和峰匹配。图3R 展示了经过MSPA 峰匹配处理的总离子流图，可见峰匹配处理后不同样本的各谱峰的保留时间基本一致，有利于更合理准确地进行数据分析。

在此基础上，对4 类样本的TIC 数据分别进行PCA 和PLS-DA 分析，结果如图4 所示。其与基于特征组分峰面积数据的分析结果（图2）一致：在95%的置信区间内不同类样本区别明显，同类型不同批次样本的得分分布相近。图5给出了PLS-DA 模型从4 类样本的TIC 图谱中筛选出的VIP > 1.0 且p< 0.05的特征变量（标记）与使用峰表数据建立的PLS-DA 判别模型发现的差异化合物（标记）相比较的结果。基于TIC 图谱选择的特征变量较多且有连续性，即这些变量对应特定组分的整体色谱流出轮廓，可以区别样本的风味成分或香味物质（表4）。例如，保留时间（RT）分别为13.162 min 的3-甲基环戊烷-1，2-二酮、14.042 min的苯乙酮、16.613 min的乙基麦芽酚、17.238 min的苯乙酸和22.733 min的反式-橙花叔醇等。根据所标识的差异物质的谱峰分布、强度变化，可看出VIP 变量与峰表特征成分基本一致，但峰表数据更直观地解释了样本差异成分。

表4 4种香精香料样本的TIC数据经多尺度谱峰匹配后得到的差异性物质Table 4 Differential compounds in the MSPA-aligned TIC data of the flavor and fragrance samples

图4 香精香料样本峰匹配后TIC数据的PCA（a） 和PLS-DA（b） 分析得分图Fig.4 PCA（a） and PLS-DA（b） score plots of the aligned TIC data of all the flavor and fragrance samples

图5 4种香精香料样本中差异成分与特征变量Fig.5 Differential components and feature variables in flavor and fragrance samples blue curve represented the average TIC profile of GC-MS data of samples，red open circle labelled the feature variables with VIP>1.0 & p<0.05 in the PLS-DA model on the MSPA-aligned TIC chromatograms，and dark green star indicated the differential components given in peak table（蓝色曲线为样本的GC-MS数据的平均TIC图谱，表示PLS-DA模型中的VIP>1.0且p<0.05的变量，表示峰表数据中的特征成分）

2.3.3 韦恩图分析叠加或交叉4 类样本的差异物质数据集绘制韦恩图（图6），可直观地展示不同样本之间的共有组分与独有特征物质，是代谢组学分析中的常用可视化工具。韦恩图将筛选出的40种差异物质按照样本类型分为A、B、C、D 4 个区域，每个区域内部包含该类样本集合的元素，重叠部分表示共同元素的集合。图6 显示A、B 和D 类样本分别具有10 种、9 种及8 种特征成分，然而C 类样本不具有不同于这三类样本的特征物质。结合表4，得到4 类样本共有3 种风味成分：4-氧代戊酸、5-羟甲基-2-呋喃甲醛、乙酸。各类样本特有的物质可作为样本识别的潜在标记物，即A 类样本中2-糠醛二乙缩醛、2-苄氧基-3-甲基-1，4-丁二醇、苯乙酮、苯甲酸乙酯、肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、7-羟基八碳二烯酸等可被认为是其标记化合物；B 类样本中2-｛3-甲基丁烯基｝环己酮、2，4-二叔丁基苯酚、糠醇、3-去氧-D-甘露醛酸、5-氧代四氢呋喃-2-甲酸甲酯、二氢-5-甲基-5-（2-甲基丙基）-2（3H）呋喃、5-乙酰氧基-4-氧代己-2-烯酸甲酯、3-呋喃甲酸甲酯等是区别该类香精香料的关键；苯乙酸、甲基偶氮氧乙酸甲酯、叔丁基酚、苹果酸二乙酯、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-羟基丙酸、5-异丙基-2-甲基环己酸乙酯等化合物有助于D类样本的鉴定。

图6 4种混合香精香料样本中差异物质的韦恩图Fig.6 Venn diagram of differential substances among four classes of flavor and fragrance samples

2.4 品质一致性分析

样本生产的时序性等客观因素使得不同批次间存在一定的质量差异。为更好地表征样本批次间的质量波动情况，对鉴定出的各类样本差异物质的相对含量均值（Mean）、标准偏差（SD）以及变异系数（CV）等进行比较分析。通常变异系数小意味着样本批次相对稳定、品质一致性好，变异系数大则表示样本批次间质量波动大、质量控制不足。以A 类样本为例，统计结果如表5 所示。可看出各批次间质量较为稳定的特征物质是变异系数为3.987%的7-氧代双环［4.2.1］壬-2，4-二烯-8-酮、4.030%的苯乙酮以及4.054%的苯甲酸乙酯；变异系数为8.522%的肉桂酸、7.560%的3-脱氧-D-甘露醇内酯以及7.222%的乙酸等物质的批次间质量波动性略大。各物质的变异系数基本保持在10%以下，说明A 类样本各批次的特征物质的质量较为稳定，批次效应小，品质一致性好。此外，通过该分析可得到各差异物质95%置信区间的相对含量范围，如在95%的置信区间内反式-橙花叔醇的相对含量为0.251%～0.264%，肉桂酸的相对含量为0.554%～0.597%。这有助于鉴别风味类型的同时监控工业生产质量。

表5 A类样本中特征差异物质相对含量的统计参数Table 5 Statistical parameters of the relative content（RC） of characteristic differential substances in flavor and fragrance samples of class A

3 结 论

本文运用GC-MS技术、代谢组学方法与风味学手段，评估不同风格特征、不同批次的香精香料样品的组成成分、品质及差异情况。结果鉴定出93种风味化合物，其中酯类物质的数量最多，其次是酮类、醇类及酸类；各致香物质在样本配方组成上差异较大，A 类49 种、B 类32 种、C 类48 种以及D 类39 种；共有挥发性化合物乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、异戊酸异戊酯、麦芽酚、二丙二醇、乙酸、4-氧代戊酸及5-羟甲基-2-呋喃甲醛可能是香精香料的重要物质组成；不同类样本的风味特征不同，A 型和C型样品中酯类含量最为丰富，通常用以柔和香气，提供果香、花香及酒香气味，B型中相对含量最高的是提供醇厚酸香特征的酸类物质，D 型香料中最多的为加强焦香、鲜果香风味的酮类致香物质。确定了肉桂酸、反式-橙花叔醇、庚酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、乙基麦芽酚、糠醇、苯乙酸、叔丁基酚、苹果酸二乙酯、乳酸乙酯、2-羟基丙酸等40种关键差异风味物质以及各类样本特有的潜在标识成分。该研究有益于促进混合香料的风味区分、复配调香、品质判断以及质量控制。