驱动蛋白家族成员15（KIF15）对肝细胞癌增殖能力的影响及其作用机制

仇建南， 汪 鹏， 曹 胤， 王忠夏， 吴俊华， 江春平

1 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科， 南京 210008

2 南京大学医学院基础医学部， 南京 210093

肝细胞癌（HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的发病率不断上升。尽管肝部分切除术和肝移植术是目前主要的治疗手段，但是很多患者确诊时已经丧失了手术机会，预后较差。虽然HCC的治疗已经取得一些新的进展，比如靶向药物治疗、免疫治疗等［1-2］。但是HCC发生发展的机制仍然需要进一步深入探究。

驱动蛋白家族成员15（KIF15）具有四聚体纺锤马达结构，其马达结构域结构以ATP样构型，颈部接头与催化核心对接；通过水解ATP 为多种物质的运输提供能量［3-4］。KIF15 在肿瘤中的作用被广泛报道，例如KIF15通过激活Raf/MEK/ERK 通路促进非小细胞肺癌的恶性进展［5］；KIF15上调促进泛素特异性蛋白酶15（USP15）介导的DEK 去泛素化导致平滑肌肉瘤细胞生长［6］；KIF15通过抑制活性氧介导的细胞凋亡促进胃癌进展［7］。目前，KIF15 在HCC 中的作用尚不确切，因此本研究旨在探究KIF15在HCC中的潜在作用机制，为HCC的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 人正常肝细胞L02，人HCC细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H 和Hep3B（中国科学院细胞库）；KIF15过表达慢病毒（LV-KIF15）和对应的阴性对照（vector），KIF15 敲低慢病毒（sh-KIF15）和对应的阴性对照（shNC）及相应的转染试剂HiTransG A/P（上海吉凯生物有限公司）；Trizol 试剂（美国Thermo Fisher 公司）；逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix 检测试剂盒与CCK8 试剂（诺唯赞生物科技有限公司）；抑制剂LY294002（MCE 公司）；EDU 试剂盒（锐博生物有限公司）；Western Blot 试剂盒（碧云天有限公司）。本研究中抗体包括KIF15、GAPDH、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）。DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司）；胰蛋白酶（新赛美公司）；青链霉素双抗（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 使用DMEM（含10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素）培养人HCC 细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H、Hep3B 和正常肝细胞L02，放于37 °C 含5% CO2的加湿培养箱中培养。每2天换液1次，当细胞生长汇合率超过85%时，胰蛋白酶消化后分皿传代培养。

1.2.2 慢病毒转染 将Hep3B 和HepG2 培养至状态良好，按每孔100 万接种于6 孔板中，进行慢病毒转染。Hep3B 转染针对KIF15 的干扰慢病毒LV-shKIF15（sh1、sh2 和sh3）以及对照（sh-NC）；HepG2 转染编码KIF15 的慢病毒载体（LV-KIF15）以及对照（vector）。使用吉凯公司助转染试剂提高转染效率。培养2天后用含嘌呤霉素（2.5 μg/mL）的DMEM筛选培养。

1.2.3 qRT-PCR 实验 将相应的HCC 细胞培养至状态良好后收集，采用Trizol 试剂提取细胞的总RNA，然后合成cDNA的反应混合物为20 μL/孔，由1 μg总RNA和4 μL 5×HiScript ⅡqRT SuperMix 及无RNase 的ddH2O 组成。qRT-PCR 的反应体系为：1 μL cDNA、5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、0.2 μL 上游引物、0.2 μL 下游引物和3.6 μL DEPC 水。设定程序：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s， 60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，40 个循环。KIF15 mRNA 的相对表达量按2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 CCK-8 实验 将稳定转染的HCC 细胞种在96 孔板（500个细胞/孔）中，分别于第1、2、3、4、5天相同时间，在每个孔加入CCK-8 溶液（10 μL/孔），在培养箱中孵育2 h后，使用酶标仪测量每孔在450 nm处的吸光度（OD）值。

1.2.5 平板克隆实验 将培养的相应的HCC细胞按每孔500 个/2 mL 培养基密度接种于6 孔板中，连续培养14 天，弃掉培养基，PBS 洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞10 min，弃掉多聚甲醛后每个孔加入2 mL 结晶紫染液，避光染色30 min 后，PBS 洗涤，等待自然干燥后，肉眼计数克隆形成的数目。

1.2.6 EdU 实验 将稳定转染的细胞株接种于96 孔板（2×104个细胞/孔）中，用DMEM 培养1天。然后，在37 ℃下用50 μmol/L 的EdU 孵育2 h。再用4%的甲醛溶液固定细胞30 min，然后用0.5%的TritonX-100 渗透细胞株10 min。加入400 μL 1×ApolloR 反应物，再加入400 μL Hoechest33342，PBS 冲洗3 次后观察EdU 阳性细胞。最后通过显微镜拍摄细胞的图像。

1.2.7 Western Blot实验 收集Hep3B和HepG2细胞，加入包含PMSF和磷酸酶蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞30 min。收集蛋白样品并检测其浓度。取30 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE（10%）凝胶电泳75 min，继而进行转膜。使用Western Blot 快速封闭液室温孵育30 min。将条带置于相应一抗（1∶1 000）中4 ℃摇床上孵育过夜。第二天用TBST洗膜3次，每次10 min。然后将条带置于特异性二抗（1∶2 000）室温孵育2 h后，再次TBST洗膜3次，每次10 min。天能凝胶成像仪显影蛋白条带。Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.2.8 动物实验 将稳定转染的sh-NC/sh3 Hep3B 细胞培养至状态良好，按1×106个细胞/100 μL PBS 的密度重悬，接种于4 周龄雌性BALB/c 裸鼠的皮下，每组3 只裸鼠，皮下注射肿瘤细胞。28 天后摘下皮下瘤，计算肿瘤体积与肿瘤重量。将瘤块石蜡包埋、切片和脱蜡，分别进行Ki67 和TUNEL 染色。实验鼠购自扬州大学比较医学中心，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2022-0009，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2022-0034。

1.2.9 生物信息学分析 使用TCGA-LIHC 数据集分析KIF15 在HCC 中的表达情况以及表达高低对临床预后的影响。GEPIA 数据库分析KIF15 在HCC 中与肿瘤分期的关系以及对预后的影响。

1.2.10 GSEA分析 为了在TCGA-HCC数据集中研究与KIF15相关的潜在信号途径，故进行GSEA分析。首先，基于与KIF15 表达的相关性，生成TCGA-HCC 的FPKM 转录数据中所有基因的有序列表。然后选择参考基因集“h.all.v6.2.entrez.Gmt”进行分析，最后使用GSEA 软件（v2.10.1）分析KIF15高、低表达组之间的基因富集情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KIF15 在HCC 中的相对表达情况和对生存率的影响 通过分析TCGA-LIHC 数据集中KIF15的表达，发现在HCC 癌组织中KIF15 的表达量显著高于正常肝组织（P＜0.05）（图1a、b）；GEPIA 数据集分析发现，KIF15 与HCC 病理学分期呈正相关（P＜0.05）（图1c）；qRT-PCR和Western Blot 分析发现KIF15 在HCC 细胞株中表达增高，同时选取表达量最高Hep3B 细胞株和较低的HepG2细胞株做后续探究（P＜0.05）（图1d、e，表1）。

表1 Western Blot 检测KIF15蛋白在HCC细胞株中的表达水平Table 1 The protein expression level of KIF15 in HCC cell lines by Western Blot

图1 KIF15在HCC中的相对表达情况和对生存率的影响Figure 1 The relative expression of KIF15 in hepatocellular carcinoma and its effect on survival rate

通过分析TCGA-LIHC 数据集中KIF15 与HCC 的生存关系，发现KIF15高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者（P＜0.05）（图1f）；分析GEPIA 数据集中KIF15与HCC 的生存关系，亦发现KIF15 高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者（P＜0.05）（图1g）。综上，KIF15在HCC中表达增高，且高表达患者生存更差。

2.2 KIF15 对HCC 增殖能力的影响 通过转染慢病毒敲低Hep3B 细胞株中KIF15 的表达量，qRT-PCR 和Western Blot实验分析发现sh3慢病毒的敲低效率最高，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B细胞的KIF15 mRNA（0.17±0.05 vs 0.99±0.03，P＜0.001）和蛋白水平（P＜0.05）均显著下降（图2a，表2），并选择sh3-Hep3B 细胞用于后续研究。其次，对转染慢病毒过表达HepG2 细胞株中KIF15的表达量，通过qRT-PCR 和Western Blot 实验分析发现，与vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的KIF15 mRNA水平（11.37±1.17 vs 1.00±0.13，P＜0.001）和蛋白水平（6.12±0.23 vs 0.99±0.06，P＜0.001）均升高（图2b）。通过CCK-8实验分析发现，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的细胞活力受到抑制（0.765±0.104 vs 1.560±0.135，P＜0.05）（图2c）；而与vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2的细胞活力显著增强（1.664±0.133 vs 1.056±0.123，P＜0.05）（图2c）。通过GEPIA数据集分析显示，KIF15在HCC中与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达呈正相关（P＜0.05）（图2d），提示KIF15 对于HCC 增殖能力可能存在促进作用。

表2 Western Blot 检测KIF15蛋白在Hep3B中的表达水平Table 2 The protein expression level of KIF15 in Hep3B by Western Blot

图2 KIF15对HCC增殖能力的影响Figure 2 Effect of KIF15 on proliferation of hepatocellular carcinoma

通过克隆形成实验分析发现，与sh-NC-Hep3B 相比，sh3-Hep3B 的克隆形成数显著减少（51.67±6.03 vs 118.33±11.59，P＜0.001）（图2e）；而与vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的克隆形成数显著增多（172.00±7.55 vs 74.67±7.57，P＜0.001）（图2f）。同时EdU 染色实验显示，与sh-NC-Hep3B 相比，sh3-Hep3B 的EdU 阳性率显著降低［（14.33±2.08）% vs （28.67±2.08）%，P＜0.01］（图2g）；而与vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的EdU阳性率显著升高［（28.67±1.53）% vs （15.00±1.73）%，P＜0.001］（图2h）。综上，KIF15能够促进HCC的增殖能力。

2.3 KIF15 对HCC 体内生长能力的影响 通过构建皮下瘤生长模型，探究KIF15 对于HCC 体内生长的影响。将稳定转染并生长状态良好的Hep3B细胞株（sh-NC/sh3）按照每100 μL中1×106个细胞的数量，接种于裸鼠皮下，造模后皮下瘤瘤体见图3a。研究结果显示，与sh-NCHep3B 细胞相比，sh3-Hep3B 细胞皮下瘤体积［（350.00±100.00）mm3vs （1 046.67±105.03）mm3，P＜0.001］和重量［（366.67±110.15）mg vs （1 166.67±76.38）mg，P＜0.001］均显著降低（图3b、c）。对皮下瘤进行免疫组化染色发现，sh3-Hep3B 细胞皮下瘤Ki67 的组化评分显著低于转染sh-NC-Hep3B 的皮下瘤（2.33±0.58 vs 7.33±1.15，P＜0.01）（图3d）；而转染sh3-Hep3B 细胞皮下瘤TUNEL 的组化评分显著高于sh-NC-Hep3B 细胞的皮下瘤（5.33±1.15 vs 1.33±0.58，P＜0.01）（图3e），提示敲低KIF15 抑制了Hep3B 皮下瘤的增殖能力，而增强了凋亡水平。综上，敲低KIF15能够抑制HCC的体内生长能力。

图3 KIF15对HCC体内生长能力的影响Figure 3 Effect of KIF15 on the growth capacity of hepatocellular carcinoma in vivo

2.4 KIF15 对HCC 增殖能力影响的机制 通过GSEA分析KIF15 在HCC 中发挥作用的潜在机制，发现KIF15与PI3K/AKT/mTOR 通路呈正相关（NES=1.59，P＜0.001）（图4a）。Western Blot实验结果表明，与sh-NC-Hep3B细胞相比，sh3-Hep3B 细胞中PI3K/AKT/mTOR 信号通路受到显著抑制（P值均＜0.001）（图4b，表3）；而与vector 组相比，过表达KIF15 能够促进HepG2 细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路显著增强（P值均＜0.001）（图4c，表4）；此外，PI3K 抑制剂LY294002 能够抑制LV-KIF15-HepG2 细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路（图4d，表5）。CCK-8实验结果表明，当LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后，LY294002+LV-KIF15-HepG2 细胞的活力较LV-KIF15-HepG2 细胞明显下降（1.084±0.118 vs 1.670±0.102，P＜0.01）（图4e）。平板克隆实验结果显示，相较于LV-KIF15-HepG2 细胞，LY294002 处理后的LV-KIF15-HepG2 细胞的克隆形成能力受到显著抑制（78.33±7.64 vs 161.67±17.56，P＜0.01）（图4f）。EdU 染色实验显示，相较于LVKIF15-HepG2 细胞，LY294002 处理后的LV-KIF15-HepG2细胞的EdU阳性率显著降低［（18.61±1.24）% vs （28.54±3.83）%，P＜0.05］（图4g）。综上，KIF15 通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进HCC的增殖能力。

表3 Western Blot 检测Hep3B细胞中相关蛋白表达结果Table 3 Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in Hep3B cells

表4 Western Blot 检测HepG2细胞中相关蛋白表达结果Table 4 Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in HepG2 cells

表5 LY294002抑制剂干预对HepG2细胞中相关蛋白表达的影响Table 5 The effect of inhibitor LY294002 intervention on the expression of related proteins in HepG2 cells

图4 KIF15对HCC增殖能力影响的机制探究Figure 4 The mechanism of the effect of KIF15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma

3 讨论

肝癌发病率和死亡率位列全球恶性肿瘤第6 位和第4位，预计到2040年全球将有140万肝癌患者，且将有130 万人死于肝癌［8］。目前HCC 的主要治疗方法是手术、介入、化疗和免疫治疗等，但是患者的复发率仍然较高，5年生存率仅约20%［9-11］。因此，探究HCC 发生和发展的机制，对HCC的诊治将提供重要的理论基础。

KIF15，又名kinesin-12，是一种微管相关蛋白，其功能是微管依赖转运或纺锤体组织的调节因子［12-13］。已有大量研究［14-15］揭示了KIF15在多种肿瘤中的作用。在胰腺癌中，KIF15通过招募USP10和磷酸甘油酸激酶1增强胰腺癌细胞的糖酵解能力，从而增强其恶性程度［16］；敲低KIF15 后，胶质瘤的增殖能力受到抑制［17］；此外，KIF15在鼻咽癌组织中高表达，与鼻咽癌预后不良相关，敲低KIF15 将抑制鼻咽癌细胞株的增殖和倾袭能力［18］。在前列腺癌中，KIF15通过增强前列腺癌细胞的雄激素受体（AR）信号通路来促进恩杂鲁胺耐药；机制上，KIF15直接结合AR/AR-v7的N端，通过增加USP14与AR/AR-v7 的蛋白结合，阻止AR/AR-v7 蛋白的降解［19］。HCC 作为恶性程度较高的常见肿瘤，KIF15对HCC的作用尚不明确。

本研究通过分析TCGA 和GEPIA 数据库发现KIF15在HCC组织中表达显著增高，且KIF15高表达与HCC不良预后相关。通过qRT-PCR 和Western Blot 评估KIF15在HCC 细胞株中的表达水平，选择HepG2 过表达KIF15以及选择Hep3B 敲低KIF15，验证过表达和敲低的效率后进行细胞实验的探究。结果显示，过表达KIF15 导致HCC 细胞株的增殖能力增强，而敲低KIF15 能够抑制HCC 细胞株的增殖；并且敲低KIF15 能够抑制HCC 的体内生长能力。上述结果表明KIF15 在HCC 中发挥促进增殖的促癌作用。

已有大量研究［20-22］报道，PI3K/AKT/mTOR 信号通路在癌症进展中发挥关键作用。TBK1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进甲状腺癌进展［23］；UHMK1通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进肺腺癌的发生［24］；STK3通过抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，降低胰腺癌细胞的增殖能力，并且促进癌细胞的凋亡［25］。本研究通过GSEA 分析发现KIF15 在HCC 中与PI3K/AKT/mTOR 的激活呈正相关。通过Western Blot分析发现，过表达KIF15能够激活HepG2细胞的PI3K/AKT/mTOR 通路，而敲低KIF15导致Hep3B 细胞的PI3K/AKT/mTOR 通路受到抑制。通过进一步实验发现，PI3K 抑制剂LY294002 能够抑制过表达KIF15的HepG2细胞中的PI3K/AKT/mTOR 通路，并且导致细胞的增殖能力受到显著抑制。

综上所述，本研究证实KIF15 通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，发挥促进HCC的增殖能力，为KIF15作为肝癌的诊断标志和预后指标提供了理论依据，但是KIF15在HCC中的精确机制仍需深入探究。

伦理学声明：本研究方案于2016 年5 月7 日经由南京大学医学院附属鼓楼医院动物保护与福利委员会批准，批号：2016-057-01，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：仇建南负责实验设计与操作，并撰写论文；汪鹏、曹胤、王忠夏负责数据分析和文章润色；江春平、吴俊华提供课题思路，指导实验内容，审阅最终文稿。