MR mDxion-Quant技术评价早期糖尿病肾病大鼠肾脏脂质沉积的实验研究*

程金梅 潘健 罗炜萧 周海鹰

(川北医学院附属医院1.放射科;2.全科医学科,四川 南充 637000)

近年来,随着人们物质条件的好转及饮食习惯的改变,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)发病率逐年上升[1]。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)作为T2DM患者常见的微血管并发症之一,已成为导致终末期肾病的主要原因[2]。但DN的发病机制较为复杂,目前尚未明了。不少学者[3-4]认为脂代谢紊乱在DN的发生和发展中起着重要作用,增多的TG 和TC 沉积于肾脏并影响肾功能,导致肾小球硬化。因此,准确评估肾脏脂肪含量并判断其严重程度对指导DN治疗、延缓DN发展及提高T2DM患者的预后具有重要意义。病理活检是评估脏器脂肪含量的金标准,但因其有创、受操作者取材影响且不能反映脏器全貌,不能作为临床诊断和随访的最佳选择。磁共振脂肪定量技术因其无辐射、多参数及可重复性等优点已越来越多地应用于科研及临床工作中,但目前应用该技术评估DN肾脏脂肪含量的文献报道较少。因此,本研究拟运用MR mDxion-Quant技术无创性评估早期DN大鼠肾脏脂质沉积,并与病理金标准进行对照,分析其与血脂水平、T2DM病程的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 本研究经川北医学院动物伦理委员会批准(NSMC伦理动物审[2021]99号)。采用6周龄健康清洁级(SPF级)雄性SD大鼠70只(川北医学院动物实验中心提供),体重160 g左右。

1.1.2 实验试剂 链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)购自美国Sigma公司。柠檬酸钠缓冲液购自中国Solarbio公司。血脂试剂盒购自高新技术产业开发区高瑞生物试剂销售中心。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及T2DM模型构建 大鼠适应性喂养3 d后,选取血糖、尿微量白蛋白阴性者列入实验对象(n=70),并随机分为对照组(n=20)和实验组(n=50)。实验组采用高脂饮食配合小剂量STZ建立T2DM模型。即给予高脂饲料喂养6周,禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg,72 h后采尾部血测血糖,以随机血糖≥16.7 mmol/L为成模标准。排除T2DM模型构建不成功的大鼠18只,将T2DM模型构建成功者32只继续喂养4～16周,依其自然病程发展成DN模型。对照组采用普通喂养,一次性腹腔注射柠檬酸钠缓冲液35 mg/kg。T2DM模型构建成功后,将实验组(n=32)、对照组(n=20)大鼠随机分为4个亚组,每组13只(实验组8只,对照组5只),分别于T2DM模型建立成功后第4、8、12、16周末,随机选择1个亚组进行肾脏MRI扫描、实验室检查及病理学检查。在T2DM模型构建成功后继续喂养的过程中,实验组大鼠共死亡15只,余下17只纳入研究;对照组共死亡5只,余下15只纳入研究。最后,根据病理结果将实验组中病理分级为Ⅰ、Ⅱ级的大鼠纳入早期DN组(n=15),将对照组中肾脏未见异常的大鼠纳入正常对照组(n=13)。

1.2.2 MRI检查方法及数据处理 分别于T2DM模型建立成功后第4、8、12、16周末,随机选择1个亚组进行肾脏MRI扫描。采用联影3.0T磁共振扫描仪(uMR790),大鼠线圈。在MRI检查前,所有大鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥钠(2%,2.3 ml/kg)进行麻醉。取俯卧位头先进方式,腹部近肾脏部位紧贴线圈中心,行肾脏冠状位扫描。T2加权成像(T2WI)采用快速自旋回波序列,成像参数为:TR=4815.5 ms,TE=96 ms,翻转角90°,层厚2.0 mm,FOV 120×120 mm,矩阵325×384。 mDxion-Quant序列成像参数为:TR=21.1 ms,TE=1.45、3.06、4.67、6.28、7.89、9.5 ms,激励次数 4,翻转角4°,层厚1.3 mm,FOV 90×146 mm,矩阵102×208。将所得图像传入联影后处理工作站,自动生成肾脏脂肪分数 (Fat fraction, FF) 图。由2名观察者(观察者分别具有2年、12年腹部MRI诊断经验)参考T2WI图像,选取肾门平面FF图,分别在双肾实质上份、中份及下份勾画感兴趣区(Region of interest,ROI)[5]。勾画 ROI 时,避开肾窦脂肪组织及伪影,系统自动生成所画区域的FF值(见图1)。每个部位测量3次,取平均值作为肾脏FF值。1个月后,观察者1以同样的方法再一次测量肾脏FF值。

图1 早期DN组大鼠肾脏MRI图像Figure 1 Coronal T2-weighted image and fat fraction image of the kidneys in early-stage diabetic nephropathy group注:A.冠状位T2WI(肾门平面);B.冠状位脂肪分数图,圆圈所示从上到下依次为左肾上份、中份及下份ROI放置位置(肾门平面,白箭示左肾门),右肾ROI的分布与左肾类似。

1.2.3 实验室检查及病理学检查 MRI扫描结束后,在麻醉状态下解剖大鼠,取大鼠中心静脉血检测血TG、TC、LDL、HDL的含量。取出大鼠肾脏组织进行HE、PAS及油红O染色(见图2)。根据肾小球形态学改变进行病理分级,Ⅰ、Ⅱ级即为早期DN[6]。观察肾组织有无脂肪染色及染色的部位,用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对油红O染色图片进行分析,计算肾脏细胞内脂滴累计光密度值/细胞总面积值(Integrated optical density/ total area of all the cells,IOD/TAC)。

图2 大鼠肾组织油红O染色(200×)Figure 2 Oil red O staining of renal tissue注:A.正常对照组;B.早期DN组。脂质(黑箭示红色颗粒)主要沉积于肾小管上皮细胞,数量明显多于对照组。

2 结果

2.1 基本资料 实验组(n=17)大鼠肾脏HE及PAS染色结果显示,肾小球基底膜增厚、系膜增生,病理分级Ⅰ级3只、Ⅱ级14只,为早期DN。排除2只MRI图像质量不佳者后,共15只大鼠纳入早期DN组;对照组(n=15)大鼠肾脏HE及PAS染色均未见异常,排除2只MRI图像质量不佳者后,共13只大鼠纳入正常对照组。

2.2 观察者内及观察者间测量肾脏FF值的一致性 2名观察者对纳入研究的28只大鼠左肾及右肾FF值测量(见表1)。一致性分析结果显示,观察者内及观察者间一致性良好(ICC均>0.9),采用观察者1和观察者2三次测量数据的平均值进行后续检验。

表1 观察者内及观察者间一致性分析Table 1 Intra-observer and inter-observer concordance analysis

2.3 早期DN组与正常对照组大鼠血脂水平及肾组织脂肪染色结果 与正常对照组比较,早期DN组大鼠TC、TG、LDL含量升高,HDL含量降低(P均<0.001)。据图2肾组织脂肪染色显示,早期DN组大鼠肾组织脂质沉积增多,主要位于肾小管上皮细胞,肾脏细胞内脂滴IOD/TAC大于正常对照组(P<0.001),且与糖尿病病程呈正相关(r=0.97,P<0.001)。见表2。

表2 正常对照组与早期DN组大鼠血脂水平及细胞内脂滴IOD/TAC 比较[M(P25,P75)]Table 2 Comparison of blood lipid parameters and IOD/TAC between control and early-stage DN groups

2.4 早期DN组及正常对照组大鼠肾脏FF值之间的比较 早期DN组及正常对照组大鼠左侧肾脏FF值与右侧肾脏FF值之间的差异均无统计学意义(P>0.05),故取右肾FF值进行后续检验。与正常对照组比较,早期DN组大鼠肾脏FF值升高(Z=-4.26,P<0.001)。见表3。

表3 正常对照组与早期DN组大鼠双侧肾脏FF值Table 3 Comparison of bilateral renal FF values between control and early-stage DN groups

2.5 早期DN组大鼠肾脏FF值与肾组织脂肪染色结果、血脂水平及糖尿病病程之间的相关性 早期DN组大鼠肾脏FF值与肾脏细胞内脂滴IOD/TAC、TC、TG、LDL含量及糖尿病病程均呈正相关(r分别为0.85、0.66、0.71、0.76、0.85)(均P<0.01),与HDL含量呈负相关(r=-0.71)(P<0.01),见表4。

表4 早期DN组大鼠肾脏FF值与各指标之间的相关性Table 4 Correlations between renal FF and the IOD/TAC, blood lipid parameters, and the progression of diabetes in early-stage DN group

3 讨论

脂毒性与DN发展密切相关,大量临床研究和动物实验[7-10]已证实DN常伴有脂代谢紊乱,包括高脂血症与脂质异位沉积。但脂代谢紊乱导致DN的发病机制较为复杂,目前尚未完全阐明。有研究[11-12]提示,脂代谢紊乱既可通过破坏肾脏正常脂质代谢直接损伤肾脏,也可通过全身炎症、氧化应激、血管损伤以及激素和其它信号分子的变化,间接影响肾脏功能。调节脂代谢紊乱对延缓DN的发生、发展具有重要意义。目前降血脂治疗已成为DN综合治疗中的重要组成部分,但效果仍存在争议。学者们越来越关注改善肾脏脂质沉积对于DN发生、发展的意义。调节肾脏脂质沉积有望成为治疗DN的潜在靶点[11]。

随着磁共振技术的不断发展,氢质子MR波谱(1H-magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)和基于化学位移的水脂分离技术等磁共振脂肪定量技术越来越多地应用于临床及科研工作中。相较于1H-MRS及病理学穿刺活检,MR mDxion-Quant技术具有无创、能反映脏器全貌、克服了磁场不均匀性、消除了组织T2*效应[13]等优点,目前已广泛应用于评价脂肪肝药物治疗的疗效、量化分析肝内铁沉积以及椎体骨髓脂肪含量的研究,并取得了较好的效果[14-17]。但国内外对于肾脏脂肪含量的研究较少,运用该技术无创性定量评估早期DN肾脏脂质沉积,并与肾组织脂肪染色结果进行对照,分析其与血脂水平相关性的研究更少。

本研究运用mDxion-Quant技术活体无创性量化早期DN大鼠肾脏的脂肪含量,并与病理金标准相对照,结果显示,早期DN组大鼠肾脏FF值与肾组织脂肪染色所得结果-细胞内脂滴IOD/TAC值呈高度正相关,证实了该技术无创性活体定量评估肾脏脂质沉积的准确性,肯定了其在肾脏这种脂肪含量极少的小器官中的应用价值,为揭示DN患者肾脏脂代谢紊乱的发生、发展以及未来相关临床药物治疗效果的评估提供了无创、便捷、有效、动态的检测手段。同时,本研究结果提示肾脏脂质沉积与DN的发生发展有着密切的关系,且随着糖尿病病程延长、血脂升高,持续高血糖、高血脂可促进脂肪酸合成和TG积累,大量游离脂肪酸通过酯化作用转化为TG,沉积于肾脏组织,导致肾脏脂质含量不断增加。沉积在肾脏的脂质可能通过促进线粒体损伤和组织炎症等机制损害各种细胞,包括足细胞、近端肾小管上皮细胞和肾小管间质组织,从而导致肾小球和肾小管病变,引发和/或加重DN[18-19]。

Yokoo等[20]运用Dixon技术测量29例T2DM患者与40例非T2DM患者的肾脏FF,结果显示T2DM患者的肾脏脂肪含量高于非T2DM患者,这提示T2DM患者发生肾脏脂肪沉积的风险增加,与本研究结果部分相似。但该研究缺乏肾脏病理学检查这一金标准作为对照,且未进一步研究肾脏脂质沉积与DN的关系;此外,该研究对照组所纳入的非糖尿病患者并非健康志愿者,而是肾脏或胰腺恶性肿瘤患者,这些恶性肿瘤对肾脏本身脂肪含量有无影响尚不明确。在此研究之后,Wang等[21]应用Dixon技术测量61例T2DM患者(其中包括40例正常白蛋白尿和21例微量白蛋白尿)和34例非T2DM志愿者肾脏FF,结果显示微量白蛋白尿组的FF值显著高于正常白蛋白尿组和对照组,该结果表明Dixon技术所测肾脏FF对T2DM患者的早期肾损害具有提示意义,与本研究结果基本一致,但同样缺乏金标准对照。

本研究实验组仅纳入早期DN大鼠,增加中晚期DN大鼠能更好地反映DN不同时期肾脏脂质沉积情况。其次,在本研究中,早期DN组纳入大鼠肾脏病理分级包括Ⅰ级和Ⅱ级,但Ⅰ级样本量较小,仅3只,故未分析肾脏FF值与肾脏病理分级之间的相关性;最后,采用人工放置ROI的方法对FF值进行测量,可能存在选择偏倚和操作误差,但本研究采用同一区域重复测量三次取平均值的方法尽量减少这种误差。

4 结论

MR mDxion-Quant技术可无创性定量评估早期DN大鼠肾脏脂质沉积。与对照组比较,早期DN大鼠肾脏脂肪含量增加,且与糖尿病病程、血TC、TG、LDL水平呈正相关,与HDL水平呈负相关。