广西产火炭母总黄酮提取工艺优化及含量测定

罗静 韦安达 朱华 谢凤凤 黄国栋 黄飘玲 杨雯琪 邓玲玉 林思 秦慧真

摘要：采用紫外可见分光光度法测定火炭母（Polygonum chinense L.）中总黄酮的含量，以总黄酮含量为考察指标，以提取方式、提取溶剂、料液比、提取时间、提取次数为考察因素，在单因素试验的基础上，采用L9（33）正交设计优化火炭母中总黄酮的提取工艺。最优提取工艺：70%乙醇为提取溶剂，料液比1∶70（m/V），超声波提取45 min，提取2次。以芦丁为对照品，在500 nm波长处测定其吸光度，平均加样回收率为98.76%，相对标准偏差为1.72%。结果表明，13个产地火炭母药材的总黄酮含量为22.205 4～52.173 7 mg/g，相对标准偏差（RSD）为1.07%～2.81%。13个产地总黄酮含量由高到低依次为桂林市、南宁市、玉林市、百色市、贺州市、河池市、贵港市、防城港市、钦州市、梧州市、来宾市、崇左市、柳州市。该方法精密度、稳定性、重复性良好，可作为广西产火炭母药材质量评价的依据。

关键词：火炭母（Polygonum chinense L.）；总黄酮；正交设计；提取工艺；紫外可见分光光度法；含量测定；广西

中图分类号：R284.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）01-0164-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.01.030 開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of extraction process and content determination of total flavonoids from Polygonum chinense L. produced in Guangxi

LUO Jing， WEI An-da， ZHU Hua， XIE Feng-feng， HUANG Guo-dong，HUANG Piao-ling，

YANG Wen-qi，DENG Ling-yu， LIN Si，QIN Hui-zhen

（Graduate School/Key Laboratory of Zhuang Yao Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning  530200，China）

Abstract： The content of total flavonoids in Polygonum chinense L. was determined by UV visible spectrophotometry. The content of total flavonoids was used as the evaluation index， and the extraction method， solvent， solid-liquid ratio， extraction time， and extraction frequency were used as the evaluation factors， on the basis of single factor experiments， L9（33） orthogonal design was used to optimize the extraction process of total flavonoids in Polygonum chinense L.. The optimal extraction process was 70% ethanol extraction solvent， with a solid-liquid ratio of 1∶70 （m/V）， ultrasonic extraction for 45 minutes， and extraction twice. Using rutin as a reference substance， its absorbance was measured at a wavelength of 500 nm， with an average recovery rate of 98.76% and a relative standard deviation of 1.72%. The results showed that the total flavonoids content of Polygonum chinense L. from 13 production areas ranged from 22.205 4 to 52.173 7 mg/g， with a relative standard deviation （RSD） of 1.07% to 2.81%. The total flavonoids content in 13 production areas was ranked as follows： Guilin City，Nanning City， and Yulin City，Baise City，Hezhou City，Hechi City，Guigang City，Fangchenggang City，Qinzhou City，Wuzhou City，Laibin City，Chongzuo City，Liuzhou City from high to low. This method had good precision， stability， and repeatability， and could be used as a basis for the quality evaluation of Polygonum chinense L. produced in Guangxi.

Key words：Polygonum chinense L.； total flavonoids； orthogonal design； extraction process； UV visible spectrophotometry； content determination； Guangxi

收稿日期：2022-06-30

基金项目：广西科技基地和人才专项（桂科AD21238031）；广西重点研发计划项目（桂科AB21196016）；广西壮瑶药重点实验室项目（桂科基字［2014］32号）；壮瑶药协同创新中心项目（桂教科研［2013］20号）；广西壮族自治区民族药资源与应用工程研究中心项目（桂发改高技函［2020］2605号）；国家自然科学基金项目（82060695）；广西中医药重点学科壮药学项目（GZXK-Z-20-64）；广西一流学科中药学（民族药学）项目（桂教科研［2018］12号）；广西科技重大专项（桂科AA23023035）

作者简介：罗 静（1998-），女，四川宜宾人，在读硕士研究生，研究方向为中药（壮瑶药）鉴定，（电话）18283121823（电子信箱）718957225@qq.com；通信作者，朱 华（1957-），男，广西南宁人，二级教授，博士，主要从事中药及民族药的鉴定与开发研究，（电话）18977165885（电子信箱）zhuhuagx@163.com；共同通信作者，韦安达（1995-），男（壮族），广西河池人，硕士，主要从事中药及民族药的鉴定与开发研究，（电话）15578025968（电子信箱）1378849858@qq.com。

火炭母药材为蓼科蓼属植物火炭母（Polygonum chinense L.）的干燥全草，又名火炭毛、火炭藤、黄鳝藤等［1］，具有清热解毒、利湿消滞、凉血止痒和明目退翳等功效［2］，具有退热、止痛、保护肝损伤等药理作用［3，4］，主要含黄酮类、酚酸类、甾体类等化学成分［5］。目前被广西地方标准收载［6］。火炭母总黄酮具有拮抗肝损伤作用，黄思茂等［7］利用D-氨基半乳糖（D-GalN）建立急性肝损伤小鼠模型，火炭母总黄酮剂量组小鼠血清或肝组织中各项指标（AST、ALT、TBIL、MDA等）水平都出现不同程度下降，GSH-Px、T-SOD、IL-10 和IL-4水平明显升高；Xu等［8］探究火炭母总黄酮护肝作用，试验发现火炭母总黄酮能使肝脏功能酶（丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶）的血液水平降低，能降低试验小鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6等炎症因子水平，表明火炭母黄酮成分能够显著缓解肝损伤病态。鉴于火炭母黄酮成分具有药用价值，本研究对火炭母总黄酮含量进行测定，优化提取工艺，为火炭母药材质量评价提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 试药

药材采自广西境内，均为野生品种。13个产地火炭母药材经广西中医药大学中药鉴定教研室滕建北教授鉴定为蓼科蓼属植物火炭母的干燥全草，具体信息如表1所示，药材经干燥后粉碎过24目筛备用。

1.2 仪器

UV-2600型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；SQP、BSA224S型电子天平，德国 Sartorius 公司；HH-6型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；Direct-Q5UV型超纯水机，美国默克密理博公司；MEDIFUGE型离心机，美国赛默飞世尔公司；KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ш型循環水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 试剂

芦丁（批号100080-201610），中国食品药品检定研究院；亚硝酸钠（批号2017030）、硝酸铝（批号20160311）、氢氧化钠（批号20170412）和甲醇（批号20160323），国药集团化学试剂有限公司；乙醇（批号2018120701），成都市科隆化学品有限公司。

2 总黄酮含量的测定

2.1 测定条件的选择

根据黄酮类化合物的性质［9，10］，利用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法进行火炭母总黄酮含量测定。称量25.32 mg芦丁，加70%乙醇溶液定容至25 mL，得到芦丁对照品溶液（1 mg/mL），称量0.05 g火炭母，加70%乙醇溶液定容至25 mL，得到火炭母供试品溶液（2 mg/mL）。取芦丁对照品溶液（火炭母供试品溶液）1.0 mL于10 mL容量瓶中，再加入1 mL亚硝酸钠溶液（50 g/L），摇匀，放置5 min；加入1 mL硝酸铝溶液（100 g/L），摇匀，放置6 min；加入4 mL氢氧化钠溶液（40 g/L），用相应提取溶剂定容至刻度，摇匀，静置15 min 显色，以等量的样品提取溶剂加显色剂同法操作，作为空白溶剂，立即测定。在波长200～800 nm范围内扫描。芦丁对照品溶液和火炭母供试品溶液均在500 nm处有稳定吸收，故选择500 nm为检测波长。

2.2 供试品溶液制备方法的考察

2.2.1 提取方式的考察 因HTM-13火炭母药材采样量大，故取该药材作为试验样品。精密称取火炭母药材粉末3份，每份0.5 g，分别精密加入70%乙醇溶液25 mL，称重，考察冷浸24 h、回流1 h、超声波30 min 3种不同提取方式的总黄酮提取率，结果（图1）表明，超声波的提取率高于其他2种方式，故选择超声波提取法。

2.2.2 提取溶剂的考察 考察去离子水、甲醇、70%乙醇溶液3种不同溶剂的总黄酮提取率，结果（图2）表明，70%乙醇溶液的提取率高于其他溶剂，故选择70%乙醇溶液为提取溶剂。

2.2.3 乙醇浓度的考察 考察60%、70%、80%、95%乙醇溶液的总黄酮提取率，结果（图3）表明，70%乙醇溶液的提取率较高，乙醇浓度继续增加，提取率下降，故选择70%的乙醇溶液。

2.2.4 料液比的考察 考察1∶30、1∶50、1∶70、1∶90 4种料液比（火炭母∶溶剂，m/V）的总黄酮提取率，结果（图4）表明，料液比为1∶70时提取率较高，提取液继续增加，提取率下降，故料液比为1∶70。

2.2.5 提取时间的考察 考察30、45、60、80 min     4个提取时间的总黄酮提取率，结果（图5）表明，提取时间为45 min时提取率较高，继续延长时间，提取率下降，60 min后曲线趋于平缓，故提取时间为45 min。

2.2.6 提取次数的考察 考察提取 1次、2次、3次、4次的总黄酮提取率，结果（图6）表明，提取次数为2次时样品中总黄酮提取率较高，继续增加提取次数，曲线趋于平缓，故提取次数为2次。

2.3 正交试验

2.3.1 正交表的选择 根据上述单因素考察结果，对提取工艺中的提取时间（A）、乙醇溶液浓度（B）、料液比（C）进行正交试验，每个因素设定3个水平，选用L9（33）表进行正交试验，因素水平表如表2所示。

2.3.2 正交试验结果 精密称取药材粉末0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，按照正交表进行正交试验，提取2次，每组重复试验3次并测定样品中总黄酮含量，结果如表3所示。

对正交试验结果进行直观分析，3个因素作用的主次顺序为A>B>C，A因素中K2最大，B因素中K2最大，C因素中K3最大，提取工艺的最优组合为A2B2C3（提取时间45 min、乙醇溶液浓度70%、料液比1∶70）。

2.3.3 提取方法的确定 正交试验中A2B2C3组合的火炭母总黄酮含量最高，为48.26 mg/g，直观分析正交试验结果得到的最佳提取工艺为A2B2C3，二者一致，因此，提取工艺的最优组合为A2B2C3，以70%乙醇溶液为提取溶剂，料液比1∶70，超声波提取45 min，提取2次。

2.4 方法学考察

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，置于25 mL棕色容量瓶中，加70%乙醇溶液至刻度线，摇匀，即得浓度为0.214 0 mg/mL的芦丁对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 精密称取火炭母粉末0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液35 mL，称重，超声波提取45 min，冷却至室温，称重，用70%乙醇溶液补足减失的重量，4 500 r/min离心10 min，提取2次，精密吸取2次离心后的上清液各5 mL，合并于25 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度线，即得供试品溶液。

2.4.3 标准曲线的制备 分别精密吸取0.214 0 mg/mL的芦丁对照品溶液1、2、4、6、8 mL，置于25 mL容量瓶中，按上述的显色方法显色，以70%乙醇溶液为空白对照，在500 nm波长处测定，记录吸光度（A）（表4）。以对照品溶液的浓度为横坐标，对照品溶液的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。计算得到回归方程：Y=11.051 74X+0.000 33，r2=0.999 3，对照品溶液在0.008 6～0.068 5 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液（0.068 5 mg/mL）1 mL，连续测定6次，记录对照品溶液的吸光度，均为0.756 9，相对标准偏差（RSD）为0.00%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 穩定性试验 精密称取HTM-13粉末适量，按“2.4.2”方法制备，按“2.4.3”方法测定，分别在0、2、6、12、16、24 h时测定，记录24 h内供试品溶液的吸光度，计算总黄酮含量及其相对标准偏差。结果（表5）表明，供试品溶液在24 h内稳定性较好，相对标准偏差为2.01%。

2.4.6 重复性试验 精密称取 HTM-13 粉末6份，每份0.5 g，按“2.4.2”方法制备，按“2.4.3”方法测定，记录供试品溶液的吸光度，计算总黄酮含量及其相对标准偏差。结果（表 6）表明，该方法重复性良好，相对标准偏差为 2.66%。

2.4.7 加样回收率试验 精密称取HTM-13粉末6份，每份0.1 g，分别精密加入1 mL 4.379 mg/mL的芦丁对照品溶液，按“2.4.2”方法制备供试品溶液，按“2.4.3”方法测定，记录供试品溶液的吸光度，计算总黄酮含量及其相对标准偏差。结果（表7）表明，样品的平均加样回收率为98.76%，相对标准偏差为1.72%。

2.5 13个产地样品的测定结果

精密称取火炭母样品粉末，每份0.5 g，按“2.4.2”方法制备供试品溶液，按“2.4.3”方法测定3次，记录供试品溶液的吸光度，计算总黄酮含量及其相对标准偏差，结果如表 8所示。不同产地之间存在一定的含量差异，13个产地火炭母药材的总黄酮含量为22.205 4～52.173 7 mg/g，相对标准偏差为1.07%～2.81%。13个产地总黄酮含量由高到低依次为桂林市、南宁市、玉林市、百色市、贺州市、河池市、贵港市、防城港市、钦州市、梧州市、来宾市、崇左市、柳州市。

3 小结与讨论

本试验充分考察了提取方式、溶剂、时间、次数等因素的影响，结合正交试验确定了火炭母总黄酮的最佳提取工艺，建立了广西产火炭母总黄酮含量的测定方法，该方法稳定、简便、快速，具有借鉴价值。试验发现超声波提取方式优于回流提取，提取率更高，提取时间更短，操作更简便。但并不意味着超声波提取的时间越长提取率越高，提取时间超过45 min提取率呈下降趋势，故超声波提取时间选择45 min。试验以芦丁为对照品，紫外可见分光光度法在500 nm波长处测定其吸光度，测得13个产地火炭母药材的总黄酮含量为22.205 4～52.173 7 mg/g，不同产地之间存在一定的含量差异。

结果表明，广西桂林市产火炭母总黄酮含量最高，13个产地总黄酮含量由高到低依次为桂林市、南宁市、玉林市、百色市、贺州市、河池市、贵港市、防城港市、钦州市、梧州市、来宾市、崇左市、柳州市。不同产地采收的火炭母药材总黄酮含量不一致，可能与当地气候条件、温度、湿度等有一定的关系。本研究为火炭母药材的质量评价提供了依据，对火炭母药材采摘及种植提供一定的参考价值。

参考文献：

［1］ 《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编（上）［M］. 北京：人民卫生出版社，1975.142-143.

［2］ 任恒春.火炭母和血三七化学成分及火炭母质量标准研究［D］.北京：中国医学科学院北京协和医学院，2009.

［3］ 蔡家驹，曾聪彦，梅全喜.火炭母水提物解热、退黄作用的实验研究［J］.中药材，2016，39（12）：2871-2874.

［4］ 高 雅，朱 华.火炭母醇提物对大鼠急性肝损伤的保护作用研究［J］.华西药学杂志，2012，27（3）：283-284.

［5］ 韋安达，朱 华，谢凤凤，等.民族药材火炭母的研究进展［J］.中国现代中药，2020，22（9）：1580-1586.

［6］ 广西壮族自治区食品药品监督管理局. 广西壮族自治区壮药质量标准 第一卷［M］. 南宁：广西科学技术出版社，2008.69.

［7］ 黄思茂，王梦楠，许琼梅，等.火炭母总黄酮对D-氨基半乳糖诱导的肝损伤小鼠的保护作用及其机制［J］.中药药理与临床，2018，34（2）：32-35.

［8］ XU L Y，HUANG G K，GUO X B，et al. Total flavonoids，extracted from Polygonum knotweed L.，exert beneficial hepatoprotection against liver injury［J］.Journal of cellular biochemistry，2019，     120（8）：12677-12683.

［9］ 严慧如，黄丹丹，何静娜，等.正交设计法优选火炭母中总黄酮的提取工艺［J］.广东化工，2015，42（11）：65-66.

［10］ 韦 玉，高 雅，张可锋.不同产地火炭母总黄酮含量测定［J］.安徽农业科学，2011，39（6）：3265-3266.