高灵敏度呕吐毒素时间分辨荧光快速定量检测卡的研发和应用

王振芳，王平东，邓 庆，叶 金，孙秀兰，纪 剑，谈 婷，赵 皖，肖理文

（1.中央储备粮德州直属库有限公司，山东 德州 253000； 2.中储粮江苏质检中心有限公司，南京 211155；3.国家粮食和物资储备局科学研究院粮油质量安全研究所，北京 102629；4.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；5.南京微测生物科技有限公司，南京 210031)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），又名呕吐毒素，是某些镰刀菌种产生的几种真菌毒素之一， 化学上属于真菌毒素的毛霉烯家族成员，为极性有机化合物，属于B 型毛霉烯， 化学名称为12,13－环氧－3α，7α，15－三羟基单端孢霉－9－烯－8－酮。在其分子中含有3个与其毒性相关的游离羟基(－OH)[1]。DON 最重要的物理化学性质之一是其超强的热稳定性。DON 的毒性作用包括呕吐和厌食，改变肠道和免疫功能， 减少对营养物质的吸收以及增加对感染性和慢性疾病的易感性[2]。 GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》 和GB 2715—2005《粮食卫生标准》等标准中规定了小麦和小麦粉等制品DON 的允许限量≤1 000 μg/kg。 近年来有学者对DON 及其衍生物污染情况进行调查，湖北、安徽、江苏、 河北4 省脱粒小麦受5 种镰刀菌毒素的污染较为严重且具有显著的相关性。尤其是DON 的检出率高达90.3%，45.3%样品DON 的含量超过国家限量标准1 000 μg/kg，污染较为严重[3]。

目前，常见的DON 的准确检测方法有同位素稀释液相色谱－串联质谱法（LC－MS/MS）[4]、高效液相色谱（HPLC）[5]、气相色谱（GC）、质谱（MS）、酶联免疫吸附法、胶体金免疫快速检测卡[6]、薄层层析（TLC）等技术，能够精准确定毒素的种类和含量。薄层色谱法由于其操作繁琐、耗时长、灵敏度低和特异性差等特点现已很少采用。 色谱化学技术由于对技术人员专业要求高，操作繁琐机器设备昂贵，不适合田间作业以及大量样本现场筛选。 韩丽等[7]利用间接竞争酶联免疫吸附原理制作了用于测定饲料中DON 含量的试剂盒( icELISA)，姚晶等[8]采用胶体金快速定量法检测不同水平的小麦及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量， 使用了液相色谱法对其进行验证性检测， 酶联免疫法和胶体金法的检测结果都与HPLC 的检测结果相近， 这些方法相较于HPLC 而言更加适合大批量筛检以及现场快速测定小麦及其制品中的DON 含量。

本研究利用最新的时间分辨荧光快速定量检测技术采用稀有元素“铕”作为示踪物，开发出一种用于检测粮食谷物中的DON 含量的高灵敏度呕吐毒素时间分辨荧光快速定量检测卡， 以期为粮食行业快速检测提供参考方法。

1 材料和仪器

1.1 主要试剂与耗材

时间分辨荧光微球， 南京微测生物科技有限公司；呕吐毒素单抗，实验室自制；呕吐毒素抗原，实验室自制；呕吐毒素（DON）标准品，国家粮食和物资储备局科学研究院；超纯水，实验室自制；硝酸纤维素膜（NC 膜），美国Millipore 公司；样品垫（玻璃纤维），美国奥斯龙；吸水纸，上海金标生物科技有限公司；PVC 胶板，上海金标生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

FD－600 型荧光定量快速检测仪和FD－2200 型检测卡恒温孵育器， 上海飞测生物科技有限公司；XYZ 3060 划膜仪，美国Biodot；峰航划膜喷金仪和HGS201 可编程切条机， 杭州峰航科技有限公司；GL－21M 高速冷冻离心机， 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DHG－9620A 电热鼓风干燥箱，上海天呈实验仪器制造有限公司。

2 实验方法

2.1 优化C 线划膜位置

定义硝酸纤维素140 膜（ 140NC 膜）靠近吸水纸端为上端，分别设置140NC 膜距离上端8 mm、12 mm、16 mm 处依次为C、T1、T2 线。 联动工艺的C 线位于16 mm 处， 独立工艺的C 线位于NC 膜上8 mm 位置处，C 线划膜液的浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，保持T 线划膜液浓度0.3 mg/mL 不变，检测DON 的定量值浓度点250 μg/kg 的浓度点5 个平行样，将检测浓度的精密度，即标准差与平均值的比值（CV）作为评价指标，对比这两种工艺对检测卡整体性能的影响。

2.2 喷膜稀释液的筛选

交联剂碳二亚胺（EDC）使用量10 μL/mL，抗体量15 μg/mL，T1 线划膜液浓度为0.2 mg/mL，T2 线划膜液浓度为0.1 mg/mL，划膜稀释液使用柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（12 mmol/L，pH 6.4） ，其余各项参数均保持一致， 甘氨酸–氢氧化钠缓冲液（12mM，pH 7.35）、Tris－HCl 缓冲液（12 mmol/L，pH 8.02）、硼酸－硼砂缓冲液 （12 mmol/L，pH 7.27）、HEPESNaOH 缓冲溶液（12 mmol/L，pH 8.06）。 用这四种喷膜稀释液进行喷膜并制作成检测卡用来检测带值样本，DON 的含量范围为600～5 000 μg/kg。 对比这4种喷膜稀释液体系所制作的检测卡的梯度、 均一性以及准确度。 筛选出最适合的喷膜稀释液进行EDC使用量、抗体量及T1 线和T2 线划膜浓度的优化。

2.3 划膜稀释液的筛选

EDC 使用量10 μL/mL，抗体量15 μg/mL，T1 线划膜液浓度为0.2 mg/mL，T2 线划膜液浓度为0.1 mg/mL，喷膜稀释液使用筛选出来性能较好的硼酸－硼砂缓冲液 （12 mmol/L，pH 7.27），C 线划膜液为HEPES－NaOH 缓冲液（15 mmol/L，pH 7.4）包含2%蔗糖、1%NaCl 以及0.05%P300 。 T 线划膜液为以下五种缓冲液且每种缓冲液中包含1%蔗糖、0.15%NaCl 以及0.05%P300。 5 种缓冲液包括MES－NaOH缓冲液 （10 mmol/L，pH 6.5）、Tris－HCl 缓冲液（10mmol/L，pH 7.0）、醋酸－醋酸铵缓冲液（10 mmol/L，pH 7.0）、HEPES－NaOH 缓冲液 （10 mmol/L，pH 7.4）、硼酸－硼砂缓冲液（10 mmol/L，pH 8.0），对比这5 种T 线划膜液制作的检测卡的抑制率范围以及效价（即：阴性样本检测的荧光值）、灵敏度，选出最适合的划膜稀释液进行后续优化实验。

2.4 试验设计与因素选择

根据高灵敏度呕吐毒素时间分辨荧光检测试卡在检测标准品以及样本过程中， 确定了EDC 使用量，抗体的使用量，T2 线划膜浓度以及T1 线划膜浓度是影响试剂条的效价和灵敏度的明显因素， 其中抗体量未完全按照等倍数选择， 真菌毒素检测中一般抗体量的使用范围在5～30 μg/mL，为了摸索这一范围的抗体量对检测卡性能的影响， 故选择了以下5 个抗体浓度水平。根据这4 个主要因素，EDC 加入量（A）取10、15、20、25、30 μL/mL 这5 个水平，偶联加入的抗体量（B）5、10、15、25、30 μg/mL，T2 线划膜浓度 （C）0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL 和T1 线划膜浓度（D）0.01、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 这五个水平。 试验因素及水平表如表1 所示。 根据正交表L25（56）分别进行试验。 最后将正交实验中的五个水平的最佳选择组合后制作检测卡进行性能验证。 以DON 时间分辨荧光定量检测试剂卡的定量值浓度点250 μg/kg 的抑制率作为优化目标， 筛选出检出范围100～3 000 μg/kg 的抑制率为35%～90%、 效价在20 000 左右的最佳组合。

表1 正交试验的因素与水平设计

2.5 对比不同方法检测实际样本中DON 含量

选取来自国家粮食和物资储备局科学研究院、江苏质检中心以及南京微测生物科技有限公司的18 个质控样本，样本类型覆盖玉米、小麦以及小麦制品，其中DON 的含量范围为400～3 000 μg/kg。分别使用高效液相色谱法和高灵敏度呕吐毒素时间分辨荧光快速定量检测卡检测样本。

3 结果与讨论

3.1 独立工艺和联动工艺的选择

DON 的定量值250 μg/kg 的浓度点的检测结果的T/C 值如图1、图2 所示，独立工艺的精密度（CV值）的变动范围为1.79%～5.50%，而联动工艺的CV值在11.62%～21.84%范围。 显然独立工艺检测效果更佳，此时C 线的T/C 值CV 最小值为1.8%，C 线的划膜浓度为0.2 mg/mL。 独立工艺的C 值与T1、T2值变动是互不影响；联动工艺的C、T1、T2 值变动是相互影响的， 当C 值升高时，T1 和T2 值都是降低的，但是联动工艺造成它们的变化幅度并不可控。标准品检测的浓度CV 值尚且变化幅度较大， 当检测实际样本时， 由于基质效应会给检测结果造成更大的误差。 独立工艺的C、T1 和T2 值变化趋势是同向的，这就使得T/C 值能保持相对稳定。

图1 独立工艺C、T 值及CV 变化

图2 联动工艺的C、T 值及T/C 的CV 变化

3.2 喷膜稀释液的优化

用甘氨酸–氢氧化钠缓冲液 （12 mmol/L，pH 7.35）、Tris－HCl 缓冲液（12 mmol/L，pH 8.02）、硼酸－硼砂缓冲液 （12 mmol/L，pH 7.27）、HEPESNaOH 缓冲溶液（12 mmol/L，pH 8.06）这4 种喷膜稀释液进行喷膜并制作成检测卡用来检测带值样本，DON 的含量范围为600～5 000 μg/kg。对比这4 种喷膜稀释液体系所制作的检测卡的梯度、 均一性以及准确度。 如图3 所示，4 种喷膜稀释液对比结果显而易见，其中硼酸－硼砂缓冲液（12 mmol/L，pH 7.27）的喷膜稀释液体系的带值样本T/C 值CV、 浓度CV最小，准确度达到95.00%。 因此，优选硼酸－硼砂缓冲液（12 mmol/L，pH 7.27）的喷膜稀释液体系进行后续优化实验。

图3 不同喷膜稀释液体系的DON 检测卡的带值样本结果

3.3 划膜稀释液的筛选

DON 标准品的250 μg/kg、5 000 μg/kg 的抑制率以及效价如图4 所示，Tris－HCl （10 mmol/L，pH 7.0） 的划膜液体系制作的检测卡的灵敏度（250μg/kg 的抑制率） 最高，250～5 000 μg/kg 抑制率范围达到为35.72%～94.8%，但是它的效价仅有16 576，是这5 种划膜液体系中相对较低的一种。 HEPESNaOH（10 mmol/L，pH 7.4）划膜液体系的检测卡效价为24439，是5 种中相对较高的一种，灵敏度相对较低，抑制率范围为25.78%～91.73%。 醋酸－醋酸铵（10 mmol/L，pH 7.0）、 硼酸－硼砂 （10 mmol/L，pH 8.0）和MES－NaOH（10 mmol/L，pH 6.5）划膜液体系的效价分别为19 417、20 978、21 002；抑制率范围为33.58～93.03、32.21%～92.70%和26.02%～91.04%。 由于本研究主要以开发一种高灵敏度的检测卡为目的，250 μg/kg 的抑制率是主要关注点， 且效价15 000～25 000 都是可接受的效价范围，通过其它方面的优化，可以一定程度提高效价，因此考虑灵敏度，优选Tris－HCl（10 mmol/L，pH 7.0）的划膜液体系进行后续优化实验。

图4 不同划膜稀释液体系的DON检测卡的抑制率范围和效价

3.4 正交试验结果分析

根据正交表L25（56）进行试验安排，试验结果如表2 所示。ki为因素的效价之和的平均值，R 为各因素列的极差，公式为R=kimax－kimin。极差R 值的大小代表了各因素对效价的影响关系，R 值越大，该影响因素越重要。

表2 正交试验结果

3.5 验证性试验

鉴于没有考虑因素间的交互作用及误差等因素，因此需要对最优方案试验验证。 由于T1 线的不同浓度的划膜液制作的检测卡的抑制率相差不大，而双T 线主要起到增补的效果，需要结合效价以及均一性进行选择， 若划膜浓度过低而检测的样本中DON 含量过低， 会导致未结合的抗体无法完全被NC 膜上的抗原截留，从而出现假阳性的结果。 通过正交试验得出的最优方案为A4B2C1D4组合。 由于正交试验中， 得出的是每个单一因素的最佳结果，250 μg/kg 的抑制率都较低，都在30%以下，故需将最优方案A4B2C1D4组合在一起后制作检测卡，实验结果为定量值浓度点250 μg/kg 的抑制率为39.54%，验证了试验结果的准确性。

3.6 主要工艺参数对检测卡性能的影响

根据正交试验数据处理的结果绘制出EDC 用量、 抗体量、T1 线划膜浓度、T2 线划膜浓度与效价之间的相互关系曲线，如图5 所示。

图5 （A） EDC 量对试剂条效价和灵敏度的影响；（B）抗体量对试剂条效价和灵敏度的影响；（C）T1 线划膜浓度试剂条效价和灵敏度的影响；（D）T2 线划膜浓度试剂条

3.6.1 EDC 用量的影响

如图5A 所示为EDC 用量和效价以及定量值浓度点250 μg/kg 的关系曲线图。 随着EDC 含量的增加，检测卡的效价呈现下降趋势，但是关键浓度点的抑制率反而在上升。综合考虑，宜选用第4 水平下的EDC 添加量为25 μL/mL， 此时检测卡的抑制率能够达到27.50%，效价为17 105。

3.6.2 抗体量的影响

图5B 所示为抗体量对检测卡的性能的影响，效价会随着抗体量的增加而增加，但抗体量到达25 mg/mL，效价基本趋于稳定，不再往上升，达到饱和。可能由于微球表面的羧基数量有限， 即使增加抗体量也无法继续与微球上活化后的羧基结合。 另一方面，可能由于抗体量持续增加导致空间位阻增大，灵敏度随着抗体量的增加先增加， 达到10 mg/mL 后灵敏度会相应地随之下降。 综合分析， 选择抗体量10 mg/mL 对效价和灵敏度的性能均能兼顾，此时定量值浓度点的抑制率为23.10%，效价为19 471。

3.6.3 T 线浓度对检测卡效价的影响

如图5C 所示，T2 线划膜浓度超过0.15 mg/mL后效价逐渐趋于稳定， 定量值浓度点抑制率随着划膜浓度增加而降低，抗原浓度并非越高越好，从节约成本的角度考虑，T2 线的划膜浓度为0.05 mg/mL。如图5D 所示，T1 线的划膜浓度为0.15 mg/mL，此时它的效价为21 878，抑制率为22%。 T1 线的划膜浓度增加抑制率基本保持不变， 当增加到0.2 mg/mL后抑制率呈现下降趋势， 效价在0.05～0.15 mg/mL的范围内逐渐上升，达到0.2 mg/mL 反而下降，这可能是由于NC 膜是具有一定比表面积微孔结构的薄膜，抗原通过静电作用或疏水作用与NC 膜结合，随着划膜浓度的增加，堆叠在NC 膜上的抗原量增加，加样后在表面活性剂的作用下，抗原又被大量冲走，无法与抗体一一结合。 其次，划膜浓度偏低，会导致检测卡整体的均一性较差。 综合考虑，T1 线划膜浓度为0.15 mg/mL。

3.7 实际样品检测结果对比

以液相色谱检测的结果作为参考值， 由图6 可以看出标准品标准曲线回算检测卡检测的样本浓度偏阴的结果有6 例，偏阳的结果10 例，检测值和参考值接近的样本有2 例。 由于基质效应需要对标准曲线进行调整。校正曲线后，校正值接近参考值的样本有10 例。说明采用硼酸－硼砂缓冲液（12 mmol/L，pH 7.27）体系作为喷膜稀释液，Tris－HCl（10mmol/L，pH 7.0）划膜液体系、EDC 用量25 μL/mL、抗体量10 μg/mL、T2 线划膜浓度0.05 mg/mL、T1 线划膜浓度0.15 mg/mL 制作的高灵敏度呕吐毒素检测卡可大批量、快速、准确定量被呕吐毒素污染的粮食谷物。

图6 检测值、校正值与参考值的关系图