石榴果实表面真菌的分离鉴定及致病性测定

于吕健,阳 瑾,丁 宇,李晓曼,刘峰娟,范盈盈,梁红玉,焦子伟,王 成

(1.伊犁师范大学生物与地理科学学院,新疆伊宁 835000,2.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部荒漠绿洲生态区特色农产品功能营养与健康重点实验室(部省共建)/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(乌鲁木齐)/新疆农产品质量安全实验室,乌鲁木齐 830091,3.新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】石榴(PunicagranatumL),属落叶乔木或灌木[1]。石榴果实味道甜美、含有多种营养物质以及多酚、植物色素等生物活性化合物[2-3]。新疆喀什地区气候条件有利于石榴果实水分、糖分和色素的积累,衍生出许多优质的石榴品种[4],已然形成了地区性特色。微生物病害是影响石榴品质的重要因素,其中在果实生长过程中附着于表面的真菌是病原菌主要来源之一。除机械损伤等外力因素导致的直接侵染外,自然情况下石榴果实的果萼部位也是病原菌附着的主要部位[5]。【前人研究进展】Karen等[5]统计了有关石榴微生物病害的报道,其中链格孢(Alternariaalternata)、石榴垫壳孢(Coniellagranati)、黑曲霉(Aspergillusniger)、纠错青霉(Penicilliumimplicatum)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)是石榴果实的主要致病真菌;自病害石榴果实中分离出的主要致病真菌包含青霉属(Penicilliumsp.)及其有性世代篮状菌属(Talaromyesgenus)、曲霉属(Aspergillusspp.)、石榴垫壳孢(Coniellagranati)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)[6],与Karen等[5]统计的主要致病真菌组成基本吻合。石榴果实致病真菌还有石榴痂圆孢菌(Sphacelomapunicae)、石榴拟茎点霉(Phomopsispunicae)、石榴鲜壳孢(Zythiaversoniana)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)[7]等。【本研究切入点】新疆南疆气候干燥,昼夜温差大且紫外线强度高,与其他石榴适生地的生态环境具有较大区别,其生长环境下果实表面的真菌群落组成也具有一定差异[1]。新疆喀什石榴生态系统中真菌的种类及分布,以及其对石榴果实贮藏期间品质的影响仍鲜有报道。需研究新疆喀什石榴果实表面真菌的种类。【拟解决的关键问题】将分离和鉴定新疆喀什石榴果实表面的真菌群落,研究果实表面真菌体系的组成与分布,测试其对石榴果实的致病能力,为新疆喀什石榴果实病害的预防与治理提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 石 榴

供试石榴样本主要来源于新疆喀什地区叶城县和疏附县石榴生产基地,于2021年10月在不同乡村共采集20份石榴样本,空运至新疆农业科学院。每份样本中随机选取5个大小适中、成熟度适宜、无伤口、无机械损伤的果实进行表面真菌的分离鉴定,并挑选同一采样地品相相近的石榴进行致病性测试。

1.1.2 仪器与试剂

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(北京陆桥技术股份有限公司);无水乙醇(分析纯)(天津市鑫铂特化工有限公司);真菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);PCR扩增试剂盒(2×TaqPCR MasterMix)(天根生化科技(北京)有限公司);琼脂糖(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)。

仪器:ESCO AC2-4S1型生物安全柜(益世科生物(中国)有限公司);LDZF-50L型立式高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);MJPS-250型霉菌培养箱(上海精宏实验设备有限公司);Agilent SureCycler 8800型PCR仪(安捷伦科技(中国)有限公司);Nikon E200型显微镜(尼康仪器(上海)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 样品预处理

随机选取20个成熟且无损伤的石榴用无菌水擦洗表面泥土后晾干,将果萼尾部切除并保留3 mm,分别称重备用。

1.2.2 石榴表面真菌的分离纯化

将处理好的石榴用其重量2倍的无菌水浸泡振荡12 h后取出,获得的菌悬液搅匀后进行10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释,每梯度取100 μL在PDA培养基上均匀涂布并设置3个平行,25℃培养5 d后观察,根据菌落形态挑取分布较多的真菌菌落在PDA培养基上划线进行初步分离,再经25℃培养5 d后观察菌落形态,直至获得单一的原始菌落,三点法接种于PDA培养基备用。

1.2.3 石榴表面真菌的形态学鉴定

取培养5 d的纯化菌落刮取菌落表面适量菌丝体,用3 mL无菌水混合均匀后滴于载玻片上,光学显微镜400倍观察,依照《真菌鉴定手册》[8]和《半知菌属图解》[9]进行形态学鉴定。

1.2.4 石榴表面真菌的分子系统学鉴定

1.2.4.1 rDNA-ITS的提取与测序

使用索莱宝真菌基因组提取试剂盒法提取总DNA,采用2×TaqPCR Mastermix和真菌ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)进行PCR扩增。反应体系为2×Taq25.0 μL,ITS1 4.0 μL,ITS4 4.0 μL,总DNA提取液2 μL,ddH2O 15μL。PCR反应条件为94℃ 3 min;94℃ 30 s,5℃ 30 s,72℃ 45 s,30次循环;72℃ 10 min。反应后产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中进行扩增特异性检测,送至上海生工进行DNA测序。

1.2.4.2 系统发育树的构建

使用NCBI中GenBank对测序结果进行序列比对,使用MEGA 11.0软件中邻位相连法(Neighbor-Joining)比对1 000次进行系统学分析并构建发育树。

1.2.5 石榴表面主要真菌的致病性测定

参照Mei Jun Guo等[10]的方法并做了适当改进:取上述分离到的已培养7 d的真菌平板,用无菌水制得孢子悬浮液并用血球计数板计数,调整孢子浓度为1×106CFU/mL备用。挑选成熟度和大小相近的新鲜石榴洗净后用75%酒精表面消毒,待酒精完全挥发后用无菌接种铲在每个果实的表面处理3个5 mm深、等距的伤口。每个伤口注射20 μL孢子悬浮液,以等体积无菌水作空白对照,每个处理3个平行。自接种后3 d起每隔2 d观察一次果实伤口腐败情况。

2 结果与分析

2.1 石榴表面真菌的形态学鉴定

研究表明,经10-1、10-2、10-3、10-4梯度分离纯化后获得17株菌株,鉴定为6个属共7个真菌物种,菌株1菌落呈深褐色,边缘呈白色,表面平整,孢子形态为卵形,较大且有横隔膜,初步鉴定为链格孢属(Alternariasp.);菌株3菌落呈白色,表面平整且具有绒毛状气生菌丝,孢子囊呈褐色,孢子形态为圆形,初步鉴定为曲霉属(Aspergillussp.);菌株7菌落中心呈青色,边缘生长带菌丝呈白色,背面呈橙黄色,菌落绳索状,孢子为圆形,略粗糙,直径约2μm,初步鉴定为青霉属(Penicilliumsp.);菌株8菌落呈青色,分泌大量红色色素,表面平整,孢子为圆形,初步鉴定为篮状菌属(Talaromyessp.);菌株10菌落呈淡灰绿色,背面呈黄褐色,表面中心凸起,孢子为圆形,直径约4 μm,初步鉴定为青霉属(Penicilliumsp.);菌株13菌落呈灰褐色,表面具有沟壑状褶皱,分生孢子梗单生中部分枝,孢子为卵形,初步鉴定为芽枝霉属(Cladosporiumsp.);菌株14菌落呈白色,表面平整,有白色绒毛,孢子为圆形,初步鉴定为丝状真菌属(Amorphothecasp.)。图1

图1 7种石榴表面分离真菌菌落及孢子形态

2.2 石榴表面真菌的分子系统学鉴定

研究表明,菌株1与链格孢属(Alternariasp.)亲缘较近,基因序列与水葫芦链格孢(Alternariaeichhorniae)的相似度为100%,结合菌落和孢子形态,该菌株为水葫芦链格孢;菌株3与曲霉属(Aspergillussp.)亲缘较近,基因序列与琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)的相似度为92%且被归为同一分支,结合菌落和孢子形态,该菌株为琉球曲霉;菌株7和菌株10与青霉属(Penicilliumsp.)亲缘较近,其中菌株7的基因序列与阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)的相似度为100%,结合菌落和孢子形态,该菌株为阿氏青霉,菌株10的基因序列与意大利青霉(Penicilliumitalicum)的相似度为97%且被归为同一分支,结合菌落和孢子形态,该菌株为意大利青霉;菌株8与篮状菌属(Talaromyesgenus)亲缘较近,基因序列与红色篮状菌(Talaromyesrubrifaciens)的相似度为93%且被归为同一分支,结合菌落和孢子形态,该菌株为红色蓝状菌;菌株13与芽枝霉属(Cladosporiumsp.)亲缘较近,基因序列与南极枝孢菌(Cladosporiumantarcticum)的相似度为81%,结合菌落和孢子形态,该菌株为南极枝孢菌;菌株14与丝状真菌(Amorphothecasp.)亲缘较近,基因序列与煤油霉菌(Amorphothecaresinae)的相似度为100%,结合菌落和孢子形态,该菌株为煤油霉菌。图2

图2 7株石榴表面分离真菌rDNA-ITS序列系统发育树

2.3 石榴表面分离真菌对石榴损伤部位

研究表明,琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)与意大利青霉(Penicilliumitalicum)接种5 d时可见接种点处果皮腐烂迹象,7 d时果皮病斑明显,且病斑处硬度均显著下降:琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)接种9 d时病斑表面产生大量气生菌丝,接种点有菌丝凸出并且果实内部伴有大量孢子产生,纵向腐坏较深,临近籽粒结构已完全腐坏;意大利青霉(Penicilliumitalicum)接种7 d时接种点有菌体凸出并伴有孢子产生,9 d时果实内部籽粒结构破坏,纵向腐坏较浅,但分生孢子较少。水葫芦链格孢(Alternariaeichhorniae)与阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)对果皮致腐能力较弱,接种9 d时未见果皮表面产生明显病斑,接种点硬度未明显下降:水葫芦链格孢(Alternariaeichhorniae)接种5 d时自接种点长出绒毛状菌丝,9 d时内部相邻籽粒果肉腐坏严重,纵向腐坏较深,但种皮结构仍然保留;阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)接种点表面果皮腐烂不明显,7 d时可见接种孔有少量分生孢子产生,9 d时纵切面可见果皮内侧轻度腐坏,内部临近籽粒腐坏分生孢子较多,内部菌丝向外扩散较小,纵向腐坏较浅。红色篮状菌(Talaromyesrubrifaciens)、南极枝孢菌(Cladosporiumantarcticum)和煤油霉菌(Amorphothecaresinae)观察期间接种点表面变化与无菌水处理无较大区别,接种9 d时未见较大致腐能力,接种点表面无病斑产生,未见硬度明显下降,9 d纵切面仅红色篮状菌(Talaromyesrubrifaciens)接种点果皮与籽粒交界处有少量孢子产生,籽粒结构保存相对正常,未见明显菌丝侵染腐坏。图3

3 讨 论

3.1研究从新疆喀什石榴的果实表面分离纯化了17株真菌菌株,结合形态学与分子系统学鉴定,初步鉴定为7个菌种,主要来自链格孢属(Alternariasp.)、曲霉属(Aspergillussp.)、青霉属(Penicilliumsp.)、篮状菌属(Talaromyesgenus)、芽枝霉属(Cladosporiumsp.)和丝状真菌(Amorphothecasp.)。新疆南疆气候条件下石榴生态系统中真菌的种类及分布仍有待进一步探明。

在致病性测定部分,琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)和意大利青霉(Penicilliumitalicum)表现出对果实果皮较高的致腐渗透能力,受侵染部位内部的籽粒结构也遭到破坏,同属青霉属(Penicilliumsp.)的阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)也同样表现出对果皮的渗透,与相关曲霉属(Aspergillussp.)、青霉属(Penicilliumsp.)导致的石榴果实病害研究成果吻合[11-13]。此外,研究中水葫芦链格孢(Alternariaeichhorniae)在人为接种条件下对果实内部籽粒也具有较高的致腐能力,但对果皮、种皮等植物防御结构未表现较高的致腐分解能力,推测在自然条件下完整的石榴果皮将是阻碍其侵染的主要因素之一。研究还发现了红色篮状菌(Talaromyesrubrifaciens)、南极枝孢菌(Cladosporiumantarcticum)和煤油霉菌(Amorphothecaresinae)在石榴果实表面的分布,均未表现出对果皮或籽粒明显的致腐能力,其在石榴生态系统中的功能和与石榴间的相互作用仍未可知。篮状菌属(Talaromyes)是近年来微生物色素研究的热门菌属,其属内的一些成员具有分泌体外色素的能力且不产生真菌毒素[14],相关研究中这些分泌色素的篮状菌多分离自土壤和海洋等自然环境[15],自植物体表面分离仍鲜有报道,研究中分离的红色篮状菌(Talaromyesrubrifaciens)具有显著分泌体外红色素的能力,且肉眼观察色素颜色与石榴籽粒色素相近,其作为色素生产菌株的潜力仍有待进一步研究。

3.2采后贮藏期是石榴果实病害的高发时期[16]。孙劲等[17]对四川凉山地区贮藏石榴干腐、软腐病的主要致病菌进行了分离鉴定,得到的主要致病菌为石榴垫壳孢(Coniellagranati)、黑曲霉(Aspergillusniger)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和光孢青霉(Penicilliumglabrum),与畅引东等[18]鉴定的山西洪洞县石榴主要致病菌组成相似;Mei Jun Guo等[9]从来自北京超市的石榴软腐病斑中分离鉴定了3株塔宾曲霉(Aspergillustubingensis),其对石榴果实的致病性远高于黑曲霉(Aspergillusniger);付娟妮等[19]鉴定了葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)是西安净皮甜石榴采后干腐病的主要致病菌。新疆地区石榴采后贮藏致病菌相关的报道也发现了紫变青霉(Penicilliumpurpurogenum)是新疆喀什甜石榴贮藏期褐腐病的主要致病菌[20],曲霉属(Aspergillussp.)和青霉属(Penicilliumsp.)可能是新疆石榴采后贮藏的主要致病微生物。

4 结 论

研究分离自新疆喀什石榴表面的7株真菌中,青霉属(Penicilliumsp.)占比较多,琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)与意大利青霉(Penicilliumitalicum)对石榴果实的致病性较高。石榴垫壳孢(Coniellagranati)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)等国内其他地区石榴采后主要致病菌在研究中并未发现,新疆南疆生态条件下石榴果实主要致病菌较国内其他适生地存在一定区别。