传统腌渍蔬菜中高产AI-2 信号分子乳酸菌的筛选及其益生特性

吕欣然，刘雪晴，顾振辰，吕孟敏，励建荣*，檀茜倩，崔方超，白凤翎，俞张富，沈荣虎

（1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁省食品安全重点实验室 辽宁锦州121013 2 杭州萧山农业发展有限公司 杭州 311215）

群体感应（Quorum sensing，QS）是指细菌通过监测种群群体密度，进而调节其基因表达的行为，是细菌群体之间通讯和交流的一种机制[1]。目前，依据信号分子类型分为4 类群体感应系统：1）扩散信号因子（Diffusible signaling factor，DSF）群体感应，存在于革兰氏阴性菌中，具有调节细菌毒力因子与生物膜形成等功能[2]；2）寡肽（Auto-inducing peptides，AIP）类群体感应，广泛存在于革兰氏阳性细菌中[3]；3）酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）类群体感应，介导细菌种间交流；4）呋喃硼酸二酯（Autoinducer-2，AI-2）类群体感应，AI-2/LuxS 群体感应系统及其合成酶蛋白LuxS，可介导革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间的种间和种内信息交流[4]。AI-2 是细菌中同型半胱氨酸代谢的副产物[5]，其QS 系统主要参与调控生物膜形成、生物发光、细胞运动和毒力因子的表达等[6]。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是传统发酵食品中一种重要的乳酸菌，广泛应用在食品加工领域。其具有较好的抑菌性和胃肠道耐受能力，大多数植物乳杆菌菌株是公认的益生菌[7]。为有效适应生存环境变化，乳酸菌种群间会通过分泌群体感应信号增加个体间的信息交流，通过产生生物膜、细菌素等适应环境的变化[8]。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）通过AI-2/LuxS 群体感应系统调节其在肠道表面的黏附和定殖能力[9-10]。Moslehi-Jenabian 等[11]研究发现，AI-2/LuxS 群 体感应系统改善了4 种乳酸杆菌的酸适应性，增强其在胃肠道微生态系统中存活能力。AI-2/LuxS 群体感应系统可调控乳酸菌的酸耐受性和肠道定植能力，然而其调控乳酸菌的其它益生特性的能力尚不清楚。需进一步研究AI-2/LuxS 群体感应系统与乳酸菌益生特性的关系。

鉴于上述问题，本研究利用哈维氏弧菌BB170 菌株报告法，从传统腌渍蔬菜中筛选产AI-2 信号分子乳酸菌，并通过酸耐受性、胆汁耐受性、黏附性、抑菌特性和生物膜形成能力等指标，评价AI-2/LuxS 群体感应系统对乳酸菌益生特性的影响，以期为开发具有益生潜力的乳酸菌发酵剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株 乳酸菌菌株来源于安徽安庆农家自制萝卜和雪菜，辽宁葫芦岛农家自制酸菜，辽宁阜新、彰武农家自制酸黄瓜和酸菜，辽宁沈阳农家自制酸菜，辽宁锦州农家自制酸菜；鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170，北纳创联生物技术有限公司；金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、Hela 细胞，本实验室保藏。

1.1.2 培养基及试剂 MRS 液体培养基、LB 液体培养基、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；AB 培养基，山东拓普生物工程有限公司；细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、Taq PCR Master mix、DNA marker，生工生物工程（上海）股份有限公司；高糖DMEM 培养基、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素-链霉素双抗，Gibco（美国）公司。

1.2 主要设备与仪器

DL-CJ-2N 超净工作台，北京市东联哈尔仪器制造有限公司；Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪，上海谓载商贸发展有限公司：CO2培养箱，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；GI54DS 高压灭菌锅，至微仪器有限公司；IKAVortexGENIUS3 振荡器，德国IKA 公司；MoticAE2000 倒置显微镜，北京荣兴光恒科技有限公司；DYY-8C 电泳仪，北京市六一仪器厂；QuantityOne 凝胶成像系统、Imark 酶标仪，美国Bio-Rad 公司；ABIsteponeplus-PCR 仪，德国Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 高产AI-2 乳酸菌的筛选 将活化后的乳酸菌以2%接种于MRS 培养基，置37 ℃培养16 h，8 000 r/min 离心10 min，将上清液用0.22 μm滤膜过滤，得到乳酸菌无细胞上清液。

按照燕彩玲等[12]、曹素芳等[13]、张腾等[14]的方法，采用哈维氏弧菌生物发光法测定乳酸菌产AI-2 活性。信号分子AI-2 的浓度用相对荧光强度表示。Ac为待测相对荧光强度；Ai为待测样品的荧光强度值；Aj为介质对照的荧光强度值。计算公式如下：

1.3.2 luxS 基因生物学鉴定 取1 mL 过夜培养的乳酸菌菌悬液，参照DNA 快速抽提试剂盒说明书提取乳酸菌DNA。参照张腾[15]的方法设计luxS引物与PCR 反应体系和扩增条件。PCR 产物采用1%琼脂糖凝胶电泳20 min，凝胶成像系统观察扩增结果，送至上海生物工程有限公司测序。

1.3.3 生长曲线的测定 向96 孔板中加入200 μL MRS 液体培养基，将乳酸菌以2%接种于培养基中，使用全自动生长曲线仪于37 ℃每2 h 测定其OD600nm值。

1.3.4 耐酸能力的测定 将活化后的二代乳酸菌以2%的接种量接种于pH 值分别为1.5，2.5，3.5，4.5 的MRS 培养基中，37 ℃培养24 h 后移入96孔板中，测定其ODAi，以未作处理培养的乳酸菌ODAj作对照[16]。存活率计算公式：

1.3.5 耐胆盐能力的测定 将活化后的二代乳酸菌以2%的接种量接种于体积分数分别为1%，2%，3%，4%的含胆盐的MRS 培养基中[17]，测定方式同1.3.4 节。

1.3.6 抑菌能力的测定 利用双层琼脂扩散法测定筛选出的乳酸菌的抑菌能力[18]。以大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌为指示病原菌。在平板中加入10 mL 素琼脂作为底层培养基，待其凝固后，将牛津杯放在其表面，然后将含有106CFU/mL 指示菌的LB 半固体培养基倒入平板内作为上层培养基，待其凝固后，将牛津杯取出，分别在孔内加入180 μL 乳酸菌液，37 ℃培养12 h，测量抑菌圈直径。

1.3.7 生物膜形成能力的测定 向96 孔板中加入200 μL MRS 液体培养基，将乳酸菌以2%接种于培养基中，置于37 ℃分别培养24，36 h 和48 h。弃上层培养液后，用PBS 清洗2～3 次去除浮游细胞，晾干后，加100 μL 结晶紫染色15 min，去除染液后用PBS 缓慢冲洗至无色。晾干后加入200 μL 33%冰醋酸脱色，摇匀。用多功能酶标仪在OD595nm处测定其吸光度值[19]。

1.3.8 Hela 细胞黏附能力的测定 乳酸菌菌悬液的制备[20]：将活化后的2 株产AI-2 的乳酸菌和鼠李糖乳杆菌LGG（作为阳性对照）接种于MRS 液体培养基培养过夜，调整细菌浓度，使其在波长600 nm 处的吸光度为1 4000 r/min 离心10 min，收集菌体，用无菌PBS 洗涤3 次。最后用不含血清的DMEM 高糖培养基重悬。

黏附性测定[21-22]：在六孔板中预先放入20 mm×20 mm 的载玻片，将培养好的Hela 细胞调整至2×104cell/mL，接种到六孔板中使其贴壁生长，至细胞长成单层后用无菌PBS 洗涤2 次，每孔加入1 mL DMEM 和1mL 预先制备好的乳酸菌菌悬液继续培养1 h。六孔板用PBS 洗3 次，除去未黏附的乳酸菌，加入甲醛固定20 min，对载玻片进行革兰氏染色，光学显微镜下随机取20 个视野，观察并计算乳酸菌黏附数。

1.3.9 数据处理 试验均重复测定3 次，数据采用“平均数±标准差”表示。利用SPSS 23 软件对数据进行统计学分析，Origin 9.0 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 高产AI-2 信号分子乳酸菌的筛选结果

用哈维氏弧菌BB170 生物发光法从200 多株乳酸菌中筛选到10 株可产生AI-2 信号分子的乳酸菌。图1a 为乳酸菌菌株AI-2 的产生情况。在0 h，AI-2 是种间交流信号分子，刚加入的乳酸菌上清液中的信号分子未被指示菌识别，所检测到的荧光强度是哈维氏弧菌所产生。0～4 h 内，各组荧光强度逐渐下降，表明各组产生的信号分子未达到使指示菌发光的浓度，荧光强度在4 h 最低，之后逐渐升高，说明4 h 是报告菌株诱导发光的阈值时间，因此，以4 h 测定的荧光强度来计算最为准确。本结果与蔡针华[23]的研究结果相近，各组发光强度均在4 h 达到最低点，相对荧光强度计算时间以孵育4 h 为基准点。图1b 为10 株乳酸菌的相对荧光强度。源自于酸菜的植物乳杆菌SCT-2 信号分子AI-2 产量远高于其它乳酸菌，植物乳杆菌DL10 产量最低，且SCT-2 产量为DL10的8.7 倍。选择以上两株植物乳杆菌做后续试验并比较。

2.2 luxS 基因生物学鉴定结果

图2a 为两株产AI-2 乳酸菌luxS 基因扩增后的电泳结果。目标条带约为477 bp，与NCBI 中植物乳杆菌luxS 基因大小相同，说明两株乳酸菌都含有luxS 基因。将其序列在NCBI 上进行BLAST 比对，选取部分同源性较高的不同菌株，用Neighbor-joining 法构建系统发育树，结果见图2b。高产AI-2 信号分子的SCT-2 与植物乳杆菌NMD-17 的luxS 基因有100%的同源性。低产信号分子的DL10 与植物乳杆菌KLDS1.0391 在同一分支且同源率达99%。

图2 luxS 基因扩增后电泳结果及系统发育树Fig.2 Electrophoresis results after luxS gene amplification and phylogenetic tree

2.3 乳酸菌的生长曲线

图3 显示AI-2 产量不同的两株乳酸菌24 h生长曲线。2 株乳酸菌的生长周期相似。2 h 时开始进入对数生长期，10 h 时达到对数生长末期，而后进入稳定期，菌密度在对数末期达到最大值，菌株SCT-2 在18 h 进入生长衰退期，而DL10 菌体密度相对稳定。排除生长特性的干扰即可做后续试验。

图3 2 株乳酸菌的生长曲线Fig.3 Growth curves of two strains lactic acid bacteria

2.4 耐酸、耐胆盐能力

益生菌对酸和胆盐的抗性是选择新益生菌候选物的基本特性，这种特性与菌株在胃肠道中的存活密切相关[24]。通常，只有很少细菌可以在pH 2.0 下存活，一部分在pH 3.0 下存活，在pH 4.0几乎所有菌株仅可维持其初始种群的80%[25]。图4a 显示两株乳酸菌在不同pH 下的存活率。两株乳酸菌在pH 1.5 和2.5 时，存活率仅为12.7%和13.6%。当pH 4.5 时，均表现出80%以上的存活率，其中高产AI-2 菌株SCT-2 存活率高出低产AI-2 菌株DL10 的8%左右。Rogers 等[26]研究了酸胁迫条件下，嗜酸乳杆菌NCFM 与鼠李糖杆菌GG的AI-2 活性变化规律，发现随着pH 的降低，AI-2 活性显著增加，说明酸胁迫下，乳酸菌会产生更多AI-2 来应对。这与本试验结果大致相似，说明luxS 基因产生的AI-2 信号分子在抗酸胁迫中发挥了关键作用。

图4 两株乳酸菌体外对酸和胆盐的耐受性分析Fig.4 Tolerance analysis of acid and bile salt tolerance of two strains lactic acid bacteria in vitro

胆汁盐是阻碍细菌存活的另一个屏障，也是胃肠道细菌细胞应激的主要因素[27]。虽然体外条件与体内情况不同，但是体外耐受能力测定可以反映菌株对胆盐的抗逆性。图4b 显示两株乳酸菌在不同胆盐含量下的存活率。两株产AI-2 的乳酸菌随胆盐浓度的升高，存活率显著下降。在胆盐含量为0.1%时，两株乳酸菌均表现出良好的存活率。当胆盐含量为0.3%和0.4%时，高产AI-2 的SCT-2 存活率为65.2%，高出DL10 存活率20%。总体看来，SCT-2 对胆盐的抗性显著高于DL10，说明产AI-2 能力好的菌株，其耐胆盐能力也更好。这与Jiang 等[28]的研究结果相似，植物乳杆菌YM-4-3 在生长对数期时，可耐受0.4%胆汁，而稳定生长期只能耐受0.2%胆汁，且luxS 基因的表达也随植物乳杆菌YM-4-3 的生长而减少，表明AI-2/LuxS 群体感应系统参与调控乳酸菌对胆盐的耐受性。

2.5 抑菌能力

表1 列出两株乳酸菌对单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌抑菌的能力，结果表明，产AI-2 的乳酸菌对革兰氏阴性菌和阳性菌均有不同程度的抑制能力（P＜0.05）。低产AI-2 的菌株DL10 对单增李斯特菌和嗜水气单胞菌的抑菌直径为（15.93±0.26）mm 和（15.80±0.13）mm，在4 种指示菌中抑制率明显低于高产AI-2 的SCT-2。SCT-2 对单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑菌直径为17.50～19.43 mm，表明高产AI-2 信号分子的植物乳杆菌SCT-2 具有较强的抑菌作用。

表1 2 株乳酸菌的抑菌能力Table 1 Bacteriostatic ability of two strains of lactic acid bacteria

2.6 生物膜形成能力

生物膜是一种复杂的微生物基质。细胞和胞外多糖、蛋白质等其它有机成分附着在生物或非生物表面可形成生物膜[29]。细菌形成的成熟生物膜可以抵抗紫外线、pH 值、渗透压等外界不利因素，并降低对常规抗菌药物的敏感性。图5a 显示两株乳酸菌在不同时间生物膜的形成能力。随着时间的延长，生物膜产量逐渐增多，且高产AI-2的菌株SCT-2 在3 个时期生物膜的形成显著高于低产AI-2 的菌株DL10（P＜0.05），生物膜产量平均提高111.4%。高产AI-2 的SCT-2 生物被膜形成能力更强，而低产AI-2 的DL10 的生物被膜形成能力较弱。E 等[30]研究显示，植物乳杆菌LIP-1的AI-2 信号分子上调可促进生物膜的形成。与本研究结果相似，说明AI-2/LuxS 群体感应系统正向调控乳酸菌生物膜的形成。

图5 两株乳酸菌在不同时间的生物膜形成能力和细胞黏附能力Fig.5 Biofilm forming ability and cells adhesion ability of two strains lactic acid bacteria at different times

2.7 Hela 细胞黏附能力测定

乳酸菌的黏附能力是发挥益生作用的首要条件[31]。苏帅等[32]以人结肠癌HT-29 细胞为黏附模型，以黏附能力较强的鼠李糖乳杆菌LGG 为阳性对照菌株，对乳酸菌的体外黏附能力进行评估，结果表明鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌单独或联合使用在HT-29 细胞上都表现出良好的黏附性。图5b为3 株乳酸菌对Hela 细胞黏附的结果，在光镜下观察Hela 细胞无明显变化，且所筛选的产AI-2乳酸菌不同程度地黏附在Hela 细胞周围。其中高产AI-2 乳酸菌SCT-2 黏附数量最多，达到102 CFU/细胞，与阳性对照相比，黏附率提高17.4%，且达到DL10 黏附数量的3 倍，黏附能力最强。低产AI-2 乳酸菌DL10 黏附数量最少，黏附能力最差。Jia 等[33]研究表明luxS 缺失的乳酸杆菌对Caco-2 细胞的黏附能力降低，且luxS 与乳酸杆菌对胃肠环境的高耐受性相关。这与本结果相似。推测AI-2 产生量与乳酸菌黏附能力呈正相关。

3 结论

乳酸菌具有抑菌、抗癌、改善肠道菌群等益生功能，是食品工业中的重要菌种。作为细菌种间交流的特殊信号分子AI-2，具有调控细菌生物膜形成、相关基因的表达等生理功能。本研究筛选获得1 株高产AI-2 的植物乳杆菌SCT-2 和低产AI-2的植物乳杆菌DL10。通过验证确定两株植物乳杆菌中均存在调控AI-2 合成的luxS 基因。与低产AI-2 乳酸菌比较，高产AI-2 植物乳杆菌SCT-2的生物膜产量、耐酸性、耐胆盐、抑菌率与细胞黏附性等特性均有提高。综上所述，AI-2/LuxS 群体感应系统具有调控乳酸菌的生物膜形成能力、耐胆盐性、抑菌能力及细胞黏附性等益生特性。