β-紫罗兰酮通过Caspase-3信号通路对乳腺癌细胞生物学行为的调控作用

王桂园 田冬雪 李 南

作者单位：473000 河南省南阳市中心医院

β-紫罗兰酮广泛存在于各种蔬菜水果以及牛奶中,是一种生物活性很强的物质,能诱导多种类型的恶性肿瘤细胞凋亡,在抑癌领域中受到广泛的关注[1-3]。有学者应用动物实验发现,β-紫罗兰酮能有效抑制大鼠乳腺癌模型的形成,但关于β-紫罗兰酮在抑制乳腺癌形成的具体作用机制尚不清楚[4-6]。但肿瘤的发生及发展与细胞异常增殖及凋亡密切相关,肿瘤细胞常无限增殖,且凋亡被抑制,进而促进肿瘤的发生。探究β-紫罗兰酮在调节人乳腺癌MCF-7细胞生物行为中的作用,有助于了解β-紫罗兰酮在抑制乳腺癌中的作用机制,基于以上背景,本文开展如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院研究所。将MCF-7细胞接种于含12%胎牛血清与青链霉素的DMEM培养基,置于细胞培养箱内,于37 ℃,5% CO2环境中培养,使用EDTA/胰酶混合液消化传代,取对数生长期细胞进行实验。

1.1.2 受试物 β-紫罗兰酮购自Sigma公司(纯度≥95%),根据细胞毒性实验,确定β-紫罗兰酮剂量分别为5 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组及200 μmol/L。

1.1.3 主要试剂 Trizol、Easy-LoadTMPCR Master Mix、BeyoRTTMcDNA第一链合成试剂盒、Hoechst 33258染色液、CCK-8检测试剂盒均购自上海碧云天。兔抗Capase-3及β-actin一抗、羊抗兔IgG(H+L)HRP标记二抗均购自美国Affinity Biosciences公司,引物均由南京金斯瑞生物科技合成。

1.1.4 试验仪器 包括ZFM-700型倒置荧光显微镜、Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳系统、T100型PCR仪及ChemiDocTMXRS+凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测细胞增殖率 对数生长期MCF-7细胞按照5×104/mL密度接种于96孔培养板,培养24 h后,空白对照组加入完全培养液100 mL,实验组分别加入不同浓度β-紫罗兰酮,每组设5个复孔,72 h后,向每孔内加入10 μL CCK-8溶液,继续孵育4 h,置于酶标仪450 nm波长下测定OD值,计算细胞增殖抑制率。

1.2.2 台盼蓝计数法检测细胞生长曲线 MCF-7细胞按照3×103密度接种于96孔培养板,培养24 h后更换为不同浓度β-紫罗兰酮,培养1～7 d,每天培养结束前4 h加入MTT 50 μL,培养结束后每孔中加入200 μL DMSO,酶标仪检测A值,计算细胞生长增殖抑制率与IC50。

1.2.3 Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡情况对数期生长MCF-7细胞以2×104/mL密度接种于12孔板,培养24 h,空白对照组及实验组处理方式同上,孵育72 h后使用4%多聚甲醛于4 ℃下固定30 min,PBS漂洗,加入Hoechst 33258染色液,荧光显微镜下观察细胞凋亡状况。

1.2.4 RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达情况 对数生长期MCF-7细胞以2×105/mL密度接种于6孔板内,培养24 h,2组处理方式同上,孵育72 h。Trizol提取细胞RNA,逆转录为cDNA,然后加入Easy-LoadTM PCR Master Mix等进行PCR扩增实验,反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃ 35 s,58 ℃ 35 s,70 ℃ 30 s,30个循环,70 ℃延伸15 min。Caspase上游引物:5'-CAGCTCATACCTGTGGCTGT-3',下游引物:5'-TTCCCTGAGGTTTGCTGCAT-3'。β-actin上游引物:5'-CTTCGCGGGCGACGAT-3',下游引物:5'-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3'。扩增产物加入琼脂糖凝胶加样孔中进行水平电泳,紫外透视下观察结果,置于凝胶成像系统内拍照,以β-actin为参照,分析Caspase-3 mRNA相对表达量。

1.2.5 Western Blot法检测Caspase-3蛋白表达水平细胞培养分组及给药同上,孵育72 h,按照Western Blot实验步骤进行蛋白提取,电泳,转膜,封闭,一抗、二抗孵育,最后进行凝胶成像,比较Caspase-3与β-tubulin蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

与空白对照组相比,经不同浓度β-紫罗兰酮处理后的乳腺癌MCF-7细胞OD值均显著下降(P<0.05),实验组中经β-紫罗兰酮浓度分别为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L处理后的MCF-7细胞增殖抑制率分别为7.92%、28.96%、45.22%和56.83%。见表1。

表1 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

2.2 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞生长的影响

不同浓度β-紫罗兰酮处理过的MCF-7细胞从第2天开始,较空白对照组的细胞计数显著降低(P<0.05),空白对照组及β-紫罗兰酮浓度25 μmol/L组MCF-7细胞计数在7 d内随时间迁移呈上升趋势,经β-紫罗兰酮浓度50、100及200 μmol/L处理后的MCF-7细胞7 d内细胞计数呈下降趋势。见表2、图1。

图1 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞生长的影响

表2 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞生长的影响

2.3 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡形态学的影响

与空白对照组相比,给予 β-紫罗兰酮处理过的人乳腺癌MCF-7细胞,Hoechst 33258荧光染色可见致密颗粒强荧光聚集,不同程度细胞核浓染、固缩及破裂等凋亡现象,200 μmol/L浓度的β-紫罗兰酮组细胞出现以上现象最明显。

2.4 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞Caspase-3 mRNA表达的影响

与空白对照组相比,经不同浓度β-紫罗兰酮处理过的MCF-7细胞Caspase-3 mRNA表达水平均显著上升(P<0.05),且随β-紫罗兰酮浓度的升高,其Caspase-3 mRNA表达呈上升趋势(P<0.05)。见表3。

表3 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞Caspase-3 mRNA表达的影响

2.5 β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞Caspase-3蛋白表达的影响

β-紫罗兰酮对人乳腺癌MCF-7细胞Caspase-3蛋白表达的影响与Caspase-3 mRNA相同。见图2。

3 讨论

乳腺癌一直是女性发病率最高的恶性肿瘤,也是造成女性病死的主要原因。积极寻找预防及治疗乳腺癌的有效措施,是提高女性生命质量的重要前提。与其他恶性肿瘤一样,乳腺癌的发生及发展涉及到细胞增殖及凋亡异常。细胞凋亡原本是一种细胞自主性死亡的形式,是机体清除衰老及异常细胞,维持内态稳定的基础之一。但当基因突变发生,细胞增殖及凋亡失衡,增殖占优势而凋亡被抑制,将诱导并促进恶性肿瘤的发生[7-10]。

β-紫罗兰酮是一种存在于瓜果蔬菜中的多酚类单体,具有异戊二烯单体成分,该成分具有很强的生物活性,在抑癌方面的功效得到了临床广泛的关注。张华磊等[11]对β-紫罗兰酮改造结果及其衍生物抗癌活性进行研究发现,β-紫罗兰酮结构中的三甲基环乙烯基、丁烯酮侧链结构改造及活动亚结构所拼接所得到的β-紫罗兰酮衍生物,在前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤中均具有一定的抑制作用,提示β-紫罗兰酮的抗癌功效,但目前,关于β-紫罗兰酮在抑癌方面的作用仅限制于细胞层面的研究,并无临床研究数据。

本研究将人乳腺癌MCF-7细胞作为研究材料,分别利用不同浓度的β-紫罗兰酮进行处理,检测细胞经β-紫罗兰酮处理后的增殖、生长及凋亡情况,结果显示,经β-紫罗兰酮处理过的MCF-7细胞细胞增殖情况被抑制,且随着β-紫罗兰酮浓度的上升,细胞增殖抑制率越高,且细胞凋亡表现越严重。绘制各分组MCF-7细胞生长曲线发现,空白对照组以及β-紫罗兰酮浓度为25 μmol/L的MCF-7细胞7 d内生长曲线呈上升趋势,但β-紫罗兰酮干预的细胞生长曲线在空白对照组之下,经β-紫罗兰酮浓度为50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L的分组细胞,7 d内生长曲线呈下降趋势。以上研究结果表明,β-紫罗兰酮干预能有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖与生长,促进细胞凋亡,且这种抑制生长促进凋亡的作用与β-紫罗兰酮浓度呈剂量型相关。

关于β-紫罗兰酮在抑制肿瘤细胞生长,促进细胞凋亡中的报道较多,但关于β-紫罗兰酮具体通过哪种信号通路实现的抑癌作用尚不清楚。已知细胞凋亡主要涉及到三条通路,而这三条通路最终都关乎到Caspase的激活,Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[12-13]。有研究报道[14-15]乳腺癌、胰腺癌组织样本中Caspase-3表达水平明显升高,Caspase-3表达与细胞凋亡及组织学侵袭性呈平行相关。本研究分别应用RT-PCR及Western Blot法检测β-紫罗兰酮处理后MFC-7细胞内Caspase-3 mRNA及蛋白表达情况发现,经不同浓度β-紫罗兰酮处理后的MCF-7细胞内Caspase-3 mRNA及蛋白表达均较对照组明显增强,证实β-紫罗兰酮能促进癌细胞凋亡。推测β-紫罗兰酮通过激活Caspase-3信号通路,抑制乳腺癌细胞增殖与生长,促进其凋亡,发挥抑癌作用。

综上所述,β-紫罗兰酮可能通过激活Caspase-3信号通路,抑制乳腺癌细胞增殖与生长,促进其凋亡,发挥抑癌作用。