DNA含量检测在尿脱落细胞病理学漏诊可疑膀胱癌患者中的临床价值

高渝霞,杨 新

(1.丰都县人民医院病理科,重庆 408200;2.中国人民解放军陆军特色医学中心病理科,重庆 400042)

膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤中最常见的恶性肿瘤,复发率较高[1]。临床上常用的检查方法包括尿脱落细胞病理学检查(简称尿检)和膀胱镜检查,但尿检的灵敏度较低[2-3],且对于较早期的少量异型细胞并不足以通过形态学给予诊断。膀胱镜检查费用昂贵,又具有侵入性,且对于微小的肿瘤病灶依然难以发现[4]。故临床期待寻找一种灵敏度、特异度均较高且无创的膀胱癌诊断方法。DNA染色是一种病理科常规的染色技术,用Feulgen 染色法可显示DNA的含量,用于肿瘤的诊断和研究,有助于判断肿瘤的良恶性及分化程度,并评估肿瘤患者的预后。对于泌尿系统肿瘤DNA含量检测是一项较新型的检测方法[5],检测的标本类型可以是尿脱落细胞、常规手术切除组织等。本研究利用尿脱落细胞进行DNA 含量检测,专门挑选常规尿检阴性的患者进行比对分析,探讨其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2020年6月在中国人民解放军陆军特色医学中心住院且病理科尿检3次为非阳性的患者56例,其中男37例,女19例,中位年龄62.3岁(25.0～86.0岁)。纳入标准:(1)年龄25～86岁;(2)行膀胱术;(3)行组织病理学检查;(4)患者及家属签署知情同意书。排除标准:尿脱落细胞病理学检查确诊为膀胱癌。

1.2 方法

1.2.1薄层白片制作

取清晨起床后第1次尿的中后段100 mL送检病理科。取50 mL 500×g离心10 min,弃上清液,再取50 mL,重复离心,至肉眼可观察到底部沉淀。向沉淀中加5 mL缓冲液,振荡均匀,转移至10 mL离心管中 500×g离心5 min,弃上清液。加0.5～1.0 mL缓冲液,振荡均匀,制成重悬细胞液,用于苏木素-伊红(HE)染色制片和Feulgen染色制片,HE染色制片采用沉降法液基细胞制片技术(liquid-based preparations,LBP):取300～500 μL重悬细胞液,滴到直径为13 mm的沉降仓,静置30 min,倒掉上清液,滴无水乙醇1 mL固定细胞,倒掉,再滴无水乙醇1 mL再次固定,倒掉,制成薄层白片。Feulgen染色制片采用离心甩片法:取1 mL重悬细胞液,滴入甩片仓,调整离心甩片机转速至4 000 r/min,离心4 min(要求在低倍镜下细胞紧凑平铺,不重叠,高倍镜下可见8～12个上皮细胞),取出玻片,即制成薄层白片。

1.2.2HE染色

LBP法所制细胞薄层白片苏木素染色1 min,水洗,无水乙醇脱水2 min×3次,0.5%伊红染色30 s,无水乙醇脱水2 min×3次,自然风干,封片。片子由1名住院医师初诊,1名主治医师复诊,1名副主任医师对疑难标本会诊。诊断结果按照2022版《尿液细胞学巴黎报告系统》[6],将“未查见肿瘤细胞”“未见癌细胞”尿液巴黎2类划为阴性,“查见极个别非典型异型细胞”“不确定”尿液巴黎3类划为不确定,“癌”“可疑癌”尿液巴黎4类及以上划为阳性。

1.2.3Feulgen染色

Feulgen染色是一种DNA染色,所制细胞薄层白片染色后可用DNA定量图像分析仪自动分析,自动出具结果。Feulgen染色步骤:离心甩片法所制细胞薄层白片,垂直放入95%乙醇染缸中固定10 min,再转入无水乙醇固定15 min,在320 mL甲醇+60 mL甲醛+20 mL冰醋酸的混合液中分化15 min,水漂洗5～6次。5 mol/L盐酸60 min,水漂洗5～6次。DNA染液染色约67 min(根据染液配制时间长短,可进行调整,需在25 ℃电热恒温培养箱中避光操作),水漂洗5～6次。95%乙醇脱水2 min,伊红染色约15 s(具体时间根据染液使用情况定)。95%乙醇浸泡(2次,2 min/次)洗去多余染液,无水乙醇(2次,2 min/次)进一步洗去多余染液并脱水,晾干,封片。片子由1名住院医师初诊,1名主治医师复诊,1名副主任医师对疑难标本会诊。

1.2.4DNA图像分析

本研究采用武汉兰丁医学高科技有限公司的全自动扫描分析系统,根据细胞着色深浅、形态、面积、积分光密度(integrated optical density,IOD),分析其DNA含量。这里的DNA含量不是绝对值,是一个相对值,标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞,对每张玻片上6 000个以上细胞核进行扫描,扫描细胞的变异系数(coefficient of variantion,CV)<5%。DNA含量检测以DNA指数(DNA index,DI)来表示,DI 1～<2为正常细胞,不正常细胞的情况有以下3种:(1) DI>2.5的细胞;(2)DI=2的细胞,即在M期,细胞数大于被检测细胞总数的10%(正常细胞M期约占整个细胞生长周期的5%～10%);(3)出现非整倍体细胞峰。

1.3 统计学处理

采用SPSS23.0软件进行数据统计学分析,计数资料采用例数和百分比表示,比较行χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 尿检结果与组织病理学诊断结果比较

56例患者中,尿检阴性35例,其中16例组织病理学诊断为阳性,19例为阴性;尿检不确定21例,其中17例组织病理学诊断为阳性,4例为阴性。尿检与组织病理学诊断一致率(即准确度)为33.93%(19/56)。

2.2 DNA含量检测与组织病理学诊断结果比较

组织病理学诊断为阳性的33例患者中, DNA含量检测阳性17例(真阳), DNA含量检测阴性16例(假阴);组织病理学诊断为阴性的23例患者中,DNA含量检测阳性8例(假阳),DNA含量检测阴性15例(真阴);故DNA含量检测的灵敏度为51.52%(17/33),特异度为65.22%(15/23),准确度为57.14%(32/56),高于尿检准确度,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 DNA含量检测、尿检与组织病理学诊断比较

尿检阴性的35例患者中,DNA含量检测阳性 9例,其中组织病理学诊断阳性4例,组织病理学诊断阴性5例;DNA含量检测阴性26例,其中组织病理学诊断阳性12例,组织病理学诊断阴性14例。尿检不确定的21例中,DNA含量检测阳性16例,其中组织病理学诊断阳性13例,组织病理学诊断阴性3例;DNA含量检测阴性5例,组织病理学诊断阳性4例,组织病理学诊断阴性1例。DNA含量检测在尿检阴性患者中的灵敏度和特异度分别为25.00%(4/16)、73.68%(14/19);在不确定患者中的灵敏度和特异度分别为76.47%(13/17)、25.00%(1/4)。

2.4 不同级别患者尿脱落细胞DNA含量检测结果对比

在组织病理学诊断为高级别膀胱癌的8例患者中,DI>2.5的患者6例(75.00%),1例细胞数高达627个(图1);在组织病理学诊断为低级别膀胱癌的25例患者中,DI>2.5的患者11例(44.00%),1例出现非整倍体细胞峰;在组织病理学诊断为阴性23例中,DI>2.5的患者8例(34.78%)。

图1 DNA含量检测结果

3 讨 论

尿液在肾脏形成,流经肾小管、肾盂、输尿管、膀胱,最后由尿道排出,故尿液中混入了泌尿系统各部位的脱落细胞,同时由于尿液中细胞易发生退变,且细胞本身存在细胞形态非典型性特点,时常给细胞学诊断带来困难,漏诊颇多。DNA含量检测,并不是一种新兴技术,但是在泌尿系统肿瘤方面的研究较少。

有研究显示,非整倍体现象在正常情况下非常罕见,是癌症的标志特征之一[7]。细胞发生癌变时,M期(有丝分裂期)发生错误,造成染色体的不稳定性和非整倍性[8-10]。近年研究发现, DNA倍体分析在诸多恶性肿瘤的鉴别诊断中具有良好的应用价值,如宫颈癌[11]、口腔癌[12-13]等。1992年之前在美国主要盛行流式细胞术对细胞内DNA含量进行评估[14],但1993年的一篇研究利用自动图像分析系统分析了膀胱癌石蜡标本DNA含量,确立了自动化图像分析的地位,该技术也可应用于尿液沉淀物的涂片或经尿道切除的肿瘤切片[15]。本研究采用国内武汉兰丁医学高科技有限公司的全自动图像分析仪进行分析[16-18],对DNA采用Feulgen染色,国内此技术在肺癌[19-22]、宫颈癌[23-26]等诸多癌症中已取得良好效果。

本研究前期成果证实,DNA含量检测联合尿检,可明显提高尿路上皮癌的检出率[27]。国内亦有很多研究证实了DNA倍体检测可提高早期癌变的诊断率,并能客观评估癌症的恶性程度,联合尿检能有效减少漏诊率[28-29]。本研究重点分析尿检结果不能佐证临床可疑膀胱癌的患者,实验结果显示,尿检为阴性和不确定的56例患者中,经组织病理学诊断确诊为膀胱癌的患者33例,证明尿检存在很大漏检。DNA含量检测阳性的患者25例中有17例组织病理学确诊为真阳。之所以存在DNA含量检测检出率高于尿检,很大一部分原因可能是细胞核内染色体数目的对数改变先于形态学改变,故较早期的癌变很难用肉眼根据形态学做出正确评估。假阴患者可能与肿瘤的部位有关,如果肿瘤部位较深,脱落的肿瘤细胞不足或当次尿液中并没有癌细胞,故不易检出。

综上所述,尿脱落细胞DNA含量检测可通过对染色体倍数的测定诊断出病变,对肿瘤细胞的良恶性鉴别做出判断,尤其在怀疑膀胱癌患者但尿检阴性和不确定患者中,DNA含量检测可为临床提供一个补充依据,有效减少尿检的漏检率,具有很高的临床应用价值。