天水地区花牛苹果主栽品种香气成分研究

张钰敏，魏珊杉，林积红，李 昭,2，李一婧,2*

（1.天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃 天水 741001；2.甘肃省大樱桃技术创新中心，甘肃 天水 741001）

我国常见的苹果品系有富士系、元帅系、金冠系与国光系，其中元帅系在甘肃省天水市花牛镇花牛村被广泛栽培，而被命名为花牛苹果。国家大力组织并实施开发‘新红星’等元帅系苹果后，花牛苹果在人工的不断移植与杂交下种类也逐渐增加，使天水地区成为全国规模最大的‘元帅’系苹果种植地[1]，花牛苹果已成为地方特色[2]，2007 年国家质检总局对天水花牛苹果实施地理标志性产品保护，花牛苹果为甘肃天水的乡村脱贫致富、全面推进乡村振兴做出了巨大贡献[3]。现天水地区主栽花牛苹果的品种有‘俄矮二号’‘天汪一号’‘首红’‘栽培二号’等。其中‘俄矮二号’为元帅系第五代苹果，1988 年于河北省中国果树所引入天水[4]。‘天汪一号’是天水果树研究所于1980 年发现的元帅系第三代红星树短枝型新品种[5]。‘首红’在1988 年于河北省中国果树所引入天水，是元帅系苹果第四代浓红型短枝芽变品种[6]。‘栽培二号’为1995 年从郑州果树所引入天水的‘元帅’系第五代品种[7]。多方引入的新品种构成了天水地区丰富的花牛苹果种质资源，也为当地作物经济发展提供了基础。

国内对花牛苹果的品质评价指标主要包含单果质量、果形指数、果实硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、固酸比和维生素C 含量等[8]。但随着果品市场的不断发展，国内外对果品品质的要求也越来越高，尤其是天然风味物质在果品加工与销售中的重要性逐渐凸显[9]。众多因素会影响果品香气成分的变化，其中果品的种类是影响香气成分构成的重要因素之一。杜薇等[10]通过分析不同种类果品的种质资源香气物质，对比出了4 种香气成分是5 个野生苹果种共有的特征香气，并且通过主成分分析方法得出特征香气物质以反式-2-己烯醛等醛类物质为主。除种类以外，果品的采摘时间[11-13]、施肥条件[14]、生长环境[15]等差异对果品香气物质具有显著影响。由于香气成分现已成为评价果品品质的重要指标之一，而果品的香气成分又受到种植条件和果园管理水平等多因素的影响，所以对不同品种果品香气成分的深入研究，不仅是品种选择和引种的依据，还为标准化栽培管理规程的制订提供参考。天水花牛苹果作为国家地理标志保护产品，对其主栽品种的香气成分研究却鲜有报道，这不利于品牌市场认可度的确立和保护。本研究通过分析花牛苹果主栽品种的挥发性风味成分组成，旨在为种植基地的品种选择和品质鉴定标准的制订提供依据，为进一步研究花牛苹果的品质变化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花牛苹果由天水市两区五县共23 个管理相当的种植基地提供，有‘俄矮二号’‘天汪一号’‘首红’和‘栽培二号’4 个品种。采样时间为2020 年8 月底至10 月初，果品大小均一，无病虫害。

1.2 香气成分测定

在一种样品中随机抽取3 个样品果，不分离果皮果肉，切至1 cm3大小碎块后混匀，取5.0 g 装入顶空进样专用20 mL 螺口瓶中，每个样品设置3 个平行。

GC 检测条件为TG-1MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱温程序：初始温度为35 ℃，以8 ℃/min 的速率升温至180 ℃，保持1 min；再以15 ℃/min 的速率升温至230 ℃，保持4 min；继续以15 ℃/min 的速率升温至250 ℃，保持5 min；进样口：控制毛细管柱（不分流）进样；MS测定使用电子轰击电离源（EI）；传输线温度280 ℃，离子源温度300 ℃；载气为高纯He；扫描方式：全扫描，范围25～500 amu。

1.3 标准谱库检索匹配度的选择

依据公式（1） 对检测到的化合物相对含量（Peak Area）进行归一化处理[16]，将原始数据进行变换把数据映射到[0,1]之间，而后采用CRITIC 权重法对比不同匹配度的准确性和适用性[17-18]。CRITIC 权重法是一种客观赋权法。权重计算时，将样本数据进行无量纲化处理，如归一化处理，即得到最终的权重，后用权重计算样本综合得分，综合得分是结合权重和具体数据相乘，得到的一个综合值，可用于综合数据进行评价，分值越高代表该数据价值越高。

式中，x*i为归一化后的值，xi为原始值，xmin为最小值，xmax为最大值。

1.4 数据处理

根据GC-MS 得到的总离子流色谱图，在NIST 谱库中进行自动检索，确定出挥发性香气成分，根据峰面积进行归一化，得出香气物质的相对含量，使用Xcalibur 软件对质谱数据进行分析。用R 语言Factoextra 包和FactoMineR 包进行主成分分析（PCA）及作图。

2 结果与分析

2.1 标准谱库检索匹配度的选择

为鉴别‘元帅’系花牛苹果香气成分构成，本试验利用GC-MS 全扫描模式对样品中所含有的全部香气成分进行测定，通过在NIST 谱库中检索，对检出化合物进行定性分析。由于受到仪器设备和样品的影响，GC-MS 检测到的物质在谱库检索时是以匹配度（Probability）进行排序，通常选择匹配度最高的化合物进行定性。但匹配度的阈值选择尚没有统一的标准，设置的标准谱库匹配度条件不同，筛选出的离子数量便有所变化。因此，本研究使用CRITIC 权重分析法评定了30%和50%两个匹配度在苹果香气成分检测中的可信度[19-20]。通过对‘俄矮二号’香气组分与标准谱库匹配度分别为≥30%和≥50%的化合物相对含量进行CRITIC 权重分析，结果见表1、2（两种条件下所得相对含量相同的物质不计入）。由表可知，标准谱库匹配度≥30%条件下‘俄矮二号’香气组分的综合指数=14%×丁酸乙酯指数+14%×异丁酸己酯指数+14%×丁酸己酯指数+30%×3,7,11-三甲基-(Z,E)-1,3,6,10-十二碳四烯指数+14%×己酸己酯指数+14%×2-甲基丁酸乙酯指数，结果为0.3。同理可得，标准谱库匹配度≥50%为条件下结果为0.7。标准谱库匹配度≥50%条件下，CRITIC 权重分析得分较高，故选用匹配度≥50%的检测结果进行分析。

表1 化合物相对含量原始分析数据Table 1 Original analysis data of relative content of compounds

表2 CRITIC 权重计算结果Table 2 CRITIC weight calculation results

2.2 花牛苹果主栽品种香气组成成分分析

不同所属族系的果实之间，香气成分构成存在一定差异。如‘元帅’系和‘富士’系的果实风味较丰富，‘国光’系次之，‘金冠’系的果实风味丰富度最小[21]。因此，对果品香气成分的深入分析，可为区别不同族系果实的鉴定方法提供一定依据。本研究选取‘俄矮二号’‘天汪一号’‘首红’和‘栽培二号’4 个常见花牛苹果栽培品种进行香气成分的分析，选取标准谱库匹配度≥50%的香气化合物进行定性，共检出22 种可挥发性成分，结果如表3 所示。

表3 花牛苹果4 个主栽品种果实中挥发性成分汇总表Table 3 Summary of volatile components in fruits of four main cultivars of Huaniu apple

由表3 可知，在匹配度≥50%条件下共检出22 种香气成分，其中，酯类物质21 种，烃类物质1 种。在‘俄矮二号’‘栽培二号’‘天汪一号’和‘首红’4 个主栽品种中均检出的香气物质有12 种，分别为异戊酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、丁酸己酯、己酸己酯、丁酸2-甲基丁酯、2-甲基丁酸丙酯和辛酸乙酯。

其中，‘俄矮二号’的香气物质种类最多，共检出20种，包含酯类物质19 种，烃类物质1 种。‘首红’‘天汪一号’‘栽培二号’三个品种中分别检出16、15、14 种香气物质，全部为酯类化合物。

由图1 可知，‘俄矮二号’所含香气物质种类较多，其中同一香气物质在不同品种中的相对含量有一定差别。如‘天汪一号’品种中异戊酸己酯占比高达49.75%，在其他品种中占比相对较少；2-甲基丁酸乙酯在‘首红’中占比为42.95%，是‘栽培二号’中占比的2.8 倍；乙酸乙酯的占比相较于其他三种，在‘俄矮二号’中最高，占比17.54%，其次为‘首红’中12.73%，‘栽培二号’11.66%和‘天汪一号’6.86%。由此结果可得出，在‘元帅’系花牛苹果主栽品种中，都存在酯类物质较丰富的现象，这表明酯类物质对果实香气组成起重要作用，与魏玉梅等[22]的研究结果一致。

图1 花牛苹果4 个主栽品种果实中香气物质分布及相对含量Fig.1 Distribution and relative content of aroma substances in fruits of four main cultivars of Huaniu apple

比较了4 个主栽品种果实中的香气物质组成，结果如图2 所示，由图知，在4 个品种中酯类物质的相对含量占比均在99%以上。共有的12 种香气物质中，异戊酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯的相对含量在4 品种中均较高，在‘俄矮二号’中分别为18.45%、31.61%和17.54%；在‘天汪一号’中分别为49.75%、26.40%和6.86%；在‘首红’中分别为19.92%、42.95%和12.73%；在‘栽培二号’中分别为35.10%、14.96%和11.66%。

图2 花牛苹果4 个主栽品种果实中香气物质组成Fig.2 Composition of aroma substances in fruits of four main cultivars of Huaniu apple

对以上结果分析可知，四个花牛苹果品种都含有较高比重的异戊酸己酯香气成分，这与路翔等[21]研究结果一致。证明此种香气物质可作为区分于其他族系苹果的特征香气成分之一，为各族系苹果提供通过香气成分鉴定的手段，也为打造花牛苹果品牌提供依据。

2.3 花牛苹果主栽品种香气特征成分分析

随着天水地区花牛苹果品种的不断丰富，其销售市场不断扩大，品牌知名度不断上升。但是现阶段各品种之间没有明确的品质鉴定与区分规程，使得农户在种植与栽培的过程中，多凭经验进行品种区分，存在较大的不确定性与误差性，进而可能导致栽培基地产出的果品质量不统一，影响当地品牌的建立与自身市场竞争力。

为解决主栽花牛苹果不同品种果实间不易区分的问题，本试验对天水地区花牛苹果主栽的品种进行了特征香气成分分析。利用主成分分析方法，对4 个主栽花牛苹果品种所测定的果实香气成分数据进行分析，结果如图3 所示。

图3 花牛苹果4 个主栽品种果实香气成分PCA 分析（标准谱库匹配度≥50%）Fig.3 PCA analysis of aroma components in fruits of four main apple cultivars (standard spectral library matching degree ≥50%)

由图3 可知，按照标准谱库匹配度≥50%条件下，PCA 分析提取出2 个主成分，PC1、PC2 累计贡献率为82.00%，可有效代表原始数据。PC1 中癸酸乙酯、己酸己酯、2-甲基丁酸丙酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸2-甲基丁酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯相关系数较大。PC2 中乙酸己酯、乙酸乙酯、丁酸辛酯、异丁酸乙酯、3,7,11-三甲基-(Z,E)-1,3,6,10-十二碳四烯、己酸丙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸2-甲基丁酯、顺式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯相关系数较大。结果显示4 个品种分别位于4 个象限中，且距离较远，各种香气物质的分布与品种形成一定聚类趋势。其中，异戊酸己酯、2-甲基丁酸乙酯和乙酸乙酯在4 个品种中相对含量均较高，而在某一品种中相对含量远高于其它品种的香气物质可作为该品种的特征香气物质，即‘俄矮二号’为乙酸乙酯（17.54%），‘天汪一号’为异戊酸己酯（49.75%）和异丁酸己酯（2.90%），‘首红’为2-甲基丁酸乙酯（42.95%）。仅在某一品种中检出（其它品种中未检出） 的香气物质亦可作为该品种的特征香气物质，‘俄矮二号’为丁酸辛酯（0.24%）、异丁酸乙酯（0.04%）和己酸丙酯（0.06%）；‘首红’为顺式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯（0.06%）；‘栽培二号’为乙酸丁酯（2.33%）。

3 结论

本文对GC-MS 标准谱库筛选条件的可靠性进行了研究，将元帅系花牛苹果主栽品种所共有和不同品种之间所有的香气成分进行了分析鉴定。通过CRITIC 权重分析将标准谱库匹配度≥50%设置为筛选条件更为合理。在此条件下，4 个花牛苹果主栽品种共检出香气物质22 种，分别为酯类和烃类，其中12 种为4 个品种所共有，且酯类物质含量最丰富，均在99%以上。对4 个品种中香气物质的相对含量进行主成分分析，得到‘俄矮二号’特征香气成分为高丰度的乙酸乙酯和特异性香气成分丁酸辛酯、异丁酸乙酯、己酸丙酯；‘天汪一号’的高丰度香气成分为异戊酸己酯和异丁酸己酯；‘首红’特征香气成分为高丰度的2-甲基丁酸乙酯与特异性香气成分顺式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯；‘栽培二号’中的特征香气成分为特异性的香气成分乙酸丁酯。由以上结果可知，不同品种花牛苹果之间存在香气成分构成差异，拥有各自对应于品种的特征香气成分。如‘新红星’品种的成熟果实中，2-甲基丁酸乙酯香气物质能够被检出，这与本试验新红星分支下，‘首红’品种的特征香气物质分析结果能够相互印证[23]。靳兰等[24]得出‘元帅’完整果实的主要香气成分为乙酸-2-甲基丁酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸丁酯等，这与本试验结果不同，可能与栽培方式、施肥条件、土壤元素等培育条件的影响有关。陶茹等[25]研究表明，套袋的栽培方式会使酯类香气产生量显著降低2.98 倍。因此，由于地理环境、土壤条件等因素使天水地区的元帅系苹果产生特有的香气物质，也构成了所属于天水地区独有的花牛苹果品牌。本试验通过分析甘肃天水地区不同主栽品种花牛苹果果实香气成分，对比了各品种之间所存在的香气成分差异，得出不同品种的特征香气成分。本研究确定的花牛苹果各品种的特征香气成分可作为地理标志农产品的判定依据之一，为花牛苹果品质鉴定和品种鉴别提供可靠的技术支持，为建立花牛苹果种质资源库提供客观依据。