基于HS-GC-IMS 技术分析桑叶发酵过程中挥发性物质的差异

李学震，孙庆泽，刘光鹏，马艳蕊，吕绪强，崔艳平，和法涛*

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究所，山东 济南 250220；2.山东省果蔬贮藏加工技术创新中心，山东 济南 250220；3.山东农业工程学院食品科学与工程学院，山东 淄博 250100）

桑叶（Folium Mori）是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）植物的叶片，富含生物碱、必需氨基酸、酚类化合物和多糖等生物活性成分[1]。其中，1-脱氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin）作为一种生物碱，在桑叶中含量为1‰左右，能有效抑制血糖生成，起到降血糖的作用[2-3]。但桑叶具有生青味与豆腥味，在饮料、茶等产品的应用过程中会产生不良风味，影响消费者感官体验。

金花菌（Aspergillus chevalieri）是茯砖茶中的一类真菌，分为有性型（Eurotium）和无性型（Aspergillus）两类，目前多数学者认为金花菌是冠突散囊菌（Eurotium cristatum）[4]。Rui 等[5]将茯砖茶中金花菌分离纯化后得到A.chevalieri、A.cristatus、E.cristatum 等多种菌株，因此有学者有认为金花菌是一类菌群。研究表明，经过金花菌发酵后能增加黑毛茶的陈香和花香，并增加黄酮类、醇类、酯类和醛类等化合物含量，减少以生青气味为特征的萜烯类物质含量和种类[6-7]。目前，关于桑叶发酵方面的研究主要集中在桑叶茶和动物饲料的加工中，直接利用金花菌发酵桑叶的研究较少，并且发酵过程中挥发性物质变化规律不明确。顶空气象离子迁移谱（HS-GC-IMS）技术是一种快速鉴别样品中挥发性物质差异性的可视化技术，常用于农产品、中药材、食品、发酵产品等的挥发性物质鉴定，具有灵敏度高、检测方便快捷、可视化程度高等优点[8]。鉴于此，本研究利用HS-GC-IMS 技术明确桑叶发酵过程中的挥发性物质差异，为桑叶提取物、果蔬发酵和动物饲料等方面的加工与应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

金花菌（A.chevalieri）分离自茯砖茶，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号：CGMCC No.23051；桑叶（干燥），山东省临清清源正本生物医药科技有限公司；PDB（马铃薯葡萄糖培养基），北京索莱宝生物科技有限公司；C4～C9混合正构酮标准品，色谱纯，济南海能仪器有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

气相色谱离子迁移谱仪，SPL-250，德国G.A.S 公司；分析天平，ME-104，梅特勒托仪器有限公司；BSC-150 恒温培养箱、YXQ-LS-100A 立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂； 恒温调速摇床柜，ZWYR-2112B，上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液制备

取保藏于-80 ℃冰箱的金花菌种子液，接入PDB 培养基中活化5～7 d，培养温度30 ℃，摇床转速150 r/min，待菌丝布满摇瓶中，根据GB 4789.2—2022 测菌落总数，制备菌落数约为1.16×108CFU/mL 的种子液。

1.3.2 桑叶发酵

取15 g 桑叶于三角瓶中，115 ℃灭菌15 min，加入12 mL 种子液，发酵温度30 ℃，分别发酵3、5、7、9、11 d，同时设置空白对照组[9]（每组设置3 个平行）。发酵好的桑叶放入60 ℃干燥箱内烘干，研磨后置于干燥器内保存备用，并分别标注A 组（未发酵）、B 组（发酵3 d）、C 组（发酵5 d）、D 组（发酵7 d）、E 组（发酵9 d）、F 组（发酵11 d）。

1.3.3 GC-IMS 检测挥发性成分

根据Wang 等[10]的方法进行检测并稍作修改。分别称取1 g 桑叶粉末于20 mL 顶空进样瓶中，每组设置3个平行，以500 r/min 的转速，40 ℃孵育15 min 后开始进样。

GC-IMS 条件：MXT-5 气相色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），IMS 温度45 ℃，色谱柱温度60 ℃，进样针温度85℃，载气/ 漂移气N2（纯度99.999%），分析时间20min，进样体积500 μL。

气相色谱条件：0～2 min，漂移气150 mL/min，载气2mL/min；2～10min，漂移气150mL/min，载气2～10mL/min；10～20 min，漂移气150 mL/min，载气10～100 mL/min。

1.4 数据处理

GC-IMS 仪器中配备的Vocal 软件进行数据查看、定性和谱图分析，使用软件内置的IMS 数据库和Hanon 数据库进行物质定性分析；Gallery 插件、Reporter 插件和Dynamic PCA 插件分别用于指纹图谱的绘制、图谱差异对比和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 发酵桑叶挥发性物质定性分析

气相离子迁移色谱（GC-IMS）是一种快速、无损和高通量的检测技术，在食品、中草药和天然产物等挥发性物质的检测中起到重要作用[11]。通过HS-GC-IMS 分析，揭示了桑叶发酵过程中挥发性物质的差异，在测试的6个样品中（A～F 组）共检出68 种挥发性物质，与数据库匹配定性出45 种，如表1 所示，主要有醇类10 种、醛类10 种、酯类9 种、酮类8 种、醚、烯和酸类各2 种、烷烃和噻唑各1 种。其中，1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、异戊醛等物质在桑叶发酵茶的研究中有所报道[12]。

表1 桑叶发酵过程中主要挥发性物质Table 1 The main volatile substances in the fermentation of mulberry leaves

2.2 桑叶发酵过程中挥发性物质差异对比

图1 是桑叶发酵过程中HC-GC-IMS 二维差异图。以未发酵的桑叶为参比，对其他发酵时间的谱图进行了扣减参比。深色表示挥发性物质高于参比，浅色表示挥发性物质低于参比，点的面积大小和颜色深浅表示该物质的相对含量多少[13]。图1 中多数信号峰的保留时间为100～400 s（400～500 s 数据不是发酵桑叶中的主要物质，因此不做分析），迁移时间为1.0～2.0 ms 区域，桑叶经过发酵后挥发性物质种类丰富，部分物质减少甚至消失。

图1 桑叶发酵过程中HS-GC-IMS 二维差异谱图Fig.1 HS-GC-IMS two-dimensional difference spectrum during mulberry leaf fermentation

结合指纹图谱（图2）分析，发酵前后共有的挥发性物质有乙二醇二甲醚、乙二醇一丁醚、甲基庚稀酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛、乙酸甲酯、反式-2-戊稀醛、丁酸乙酯、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、2-庚酮和甲基异丁基酮，这些挥发性物质都具有水果香气或花草香气（图2c）；通过‘金花菌’发酵能使苯甲醛甘油缩醛（具有苦味）、硫丙醇（具有臭味）[14]、1-辛烯-3-醇（具有土腥味）[15]、1-戊稀-3-酮（具有辛辣刺激性气味）和己醇（具有青草、嫩枝叶气味）等具有不良气味的物质消失（图2b）；增加了异丙基乙酸酯、3-羟基丁酸乙酯[16]、甲酸丁酯和2-庚酮等具有水果香气的物质，还有γ-丁内酯[17]、3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）[18]和4-甲基噻唑等物质赋予了桑叶奶油和脂肪类香气（图2a）。

图2 不同发酵时间桑叶挥发性物质指纹图谱Fig.2 Fingerprint of volatile substances in mulberry leaves at different fermentation times

2.3 发酵桑叶过程中挥发性物质聚类分析

PCA 被广泛应用于鉴别植物样本的特征成分、挥发性物质和生物活性，其有效性也被广泛证明，它能针对多个指标进行降维，转换成几个具有代表性的综合指标[19]。如图3 所示，两个主成分累计贡献率为85%，能较好地表示原始变量的特征差异，并能将未发酵、发酵3 d和发酵5～11 d 的桑叶进行区分，表明‘金花菌’发酵能明显改变桑叶中的挥发性物质。

图3 发酵桑叶过程中主成分分析Fig.3 Principal component analysis in fermentation of mulberry leaves

3 结论

将HS-GC-IMS 技术与PCA 结合，对‘金花菌’发酵桑叶过程中挥发性物质进行检测和分析。结果共检出挥发性物质45 种，主要有醇类10 种、醛类10 种、酯类9种、酮类8 种、醚、烯和酸类各2 种、烷烃和噻唑各1 种。‘金花菌’发酵能使桑叶中苯甲醛甘油缩醛、硫丙醇、1-辛烯-3-醇、1-戊稀-3-酮和己醇等具有不良气味的物质消失；增加异丙基乙酸酯、3-羟基丁酸乙酯、甲酸丁酯、2-庚酮、γ-丁内酯、3-羟基-2-丁酮和4-甲基噻唑等具有水果和奶油气味的物质。PCA 能较好地区分未发酵、发酵3 d 和发酵5～11 d 的桑叶，该研究为桑叶风味改良和桑叶茶发酵提供参考。