河南省胞内分枝杆菌临床分离株耐药特征及基因分型

王少华,常文静,苏茹月,马晓光,郑丹薇,朱岩昆,石 洁,孙国清,孙定勇,郝义彬

河南省疾病预防控制中心 郑州 450016

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌[1]。NTM在环境中分布广泛,并且对大多数抗结核药物天然耐受[2]。NTM中,鸟胞内分枝杆菌复合群(Mycobacteriumaviumcomplex,MAC)是致病NTM中全球分布最广的分枝杆菌,一项对25篇文献报道的共38 686株NTM分离株的分析结果显示,MAC在大洋洲的分离率达到61%,北美洲为51%,非洲为49%,亚洲、南美洲和欧洲达到34%[3];课题组前期研究[4]也表明河南省NTM分离株中MAC占比达78.5%。根据Runyon分类原则,MAC属于慢生长型NTM,不产色。MAC中最重要的致病菌有鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)和奇美拉分枝杆菌(M.chimaera)[5]。MAC亚种间的临床特征、毒性、致病能力及对抗菌药物的体外抗性差异较大[6],因此在临床中需要对分离的菌株进行鉴定。

可变数目串联重复序列(variable-number tandem repeat,VNTR)分型是一种以PCR技术为基础的分型方法,其操作简单,分辨率高,具有很高的可重复性,已广泛用于分枝杆菌的基因分型,包括结核分枝杆菌[7-8]、胞内分枝杆菌等[9]。本研究对河南省部分地市的胞内分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定,药敏试验和分子分型分析,旨在为胞内分枝杆菌感染性疾病的临床诊治和分子流行病学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源68株来源于2019年河南省部分地市结核病专科医院患者痰标本分离的胞内分枝杆菌菌株,其中南阳市37株、平顶山市6株、郑州市5株、洛阳市3株、周口市3株、驻马店市3株、许昌市3株、信阳市2株、濮阳市2株、鹤壁市2株、开封市2株。

1.2 菌种鉴定用接种环刮取L-J罗氏培养基上生长的分枝杆菌悬于超纯水中,95 ℃金属浴裂解20 min,12 000 r/min离心10 min,取上清备用(-20 ℃冷冻保存)。采用熔解曲线法分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(厦门致善生物科技股份有限公司)进行菌种鉴定,该试剂盒可用于临床和环境中常见的19种分枝杆菌的定性鉴定[10]。具体操作参照试剂盒说明书。采用16S rRNA、rpoB、ITS(16S～23S rRNA internal transcribed spacer)和hsp65基因联合测序对菌种进行鉴定,引物由上海生工生物工程技术有限公司(Sangon公司)参考文献[11]设计、合成。PCR反应体系(50 μL):PCR预混液2×Mix(康为世纪生物科技有限公司)25 μL,上下游引物各2 μL,DNA模板5 μL,无菌去离子水 16 μL。反应条件:预变性94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s,共计35个循环;最后72 ℃延伸 7 min。由Sangon公司测序,将基因序列提交NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性分析、比对、判定,相似度≥97%即可确定菌种。

1.3 药物敏感性测定使用含16种预制冻干药品的贝索96孔药敏板(珠海贝索生物技术有限公司)进行药敏试验,包括阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、利福平、头孢西丁、利福布汀、环丙沙星、克拉霉素、多西环素、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、莫西沙星、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和美罗培南。具体操作参照说明书。药物最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)范围和临界值的判定参照文献[12]和说明书。

1.4 VNTR分型及聚类分析采用16个VNTR基因位点方法进行分型分析[9]。引物由Sangon公司合成。PCR反应体系同1.2。反应条件:预变性94 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共计38个循环;最后72 ℃延伸 7 min。扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳,以确定其大小(以M.intracellulareATCC 13950为对照)。根据等位基因大小和基本单位长度计算等位基因重复数。使用Selander多样公式[13]计算每个基因座等位基因多样性指数(h),参考文献[14]计算汉高指数(Hunter-Gaston discriminatory index,HGDI)。使用BioNumerics 8.1(Applied Maths,SintMartensLatem,Belgium)软件对VNTR数据进行聚类分析。

1.5 统计学处理采用Excel 2010对资料进行整理,采用SPSS 19.0进行统计分析。应用χ2检验比较成簇菌株和非成簇菌株耐药率的差异,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 菌种鉴定结果经鉴定,68株均为胞内分枝杆菌。

2.2 药敏试验结果见图1。药敏试验结果显示,克拉霉素、利福布汀和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑对胞内分枝杆菌具有较好的抗菌作用,耐药率分别为11.76%(8/68)、5.88%(4/68)、8.82%(6/68),克拉霉素的抑制50%胞内分枝杆菌的MIC(MIC50)和MIC90分别为2和32 mg/L,利福布汀分别为0.5和2 mg/L,甲氧苄啶/磺胺甲恶唑分别为0.25/4.75和2/38 mg/L。同时耐药4种以上的菌株占95.59%(65/68),耐药6种以上的菌株占67.65%(46/68),耐药8种以上的菌株占16.18%(11/68);有两株(2.94%,2/68)全耐药。

图1 68株胞内分枝杆菌16种药物的MIC(mg/L)分布

2.3 VNTR分型结果VNTR基因座的等位基因多样性差异很大,h从0.014到0.590,详见表1。在16个VNTR位点中,有3个位点(VNTR7、12、13)h>0.500。

表1 68株胞内分枝杆菌VNTR等位基因分布 株

2.4 VNTR聚类分析结果经VNTR聚类分析,68株分为45个基因型,其中34株来自11个簇(成簇菌株),34株为独特模式的分离株(非成簇菌株)。68株的HGDI为0.978,见图2。最小生成树结果表明53株构成一个大簇,其余15株位于该簇周围,见图3。

图2 68株胞内分枝杆菌16位点VNTR分型聚类图

图3 根据68株胞内分枝杆菌VNTR结果构建的最小生成树

2.5 成簇和非成簇菌株的耐药率比较见表2。成簇菌株中利奈唑胺和阿米卡星耐药率高于非成簇菌株(P<0.05)。成簇菌株和非成簇菌株中克拉霉素、莫西沙星、利福平、利福布汀、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、妥布霉素、环丙沙星、多西环素和米诺环素耐药率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 成簇和非成簇菌株耐药率的比较 耐药株数(%)

*校正χ2;#:确切概率。

3 讨论

临床上,大多数NTM对常见抗结核药物耐药。我国2020版《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南》对于MAC感染者,推荐联合使用大环内酯类(阿奇霉素或克拉霉素)、利福平(利福布汀)、乙胺丁醇等药物,并根据病情变化加用氨基糖苷类药物(阿米卡星)[15]。本研究结果显示,河南省胞内分枝杆菌临床分离株对克拉霉素的耐药率为11.76%,高于王淑琦等[16]的2.67%和Lin等[17]的3.7%,与Zhao等[18]的9.6%和李远春等[19]的9.28%相当。大环内酯类是主要的抗NTM药物,临床治疗结果也表明其对MAC感染有较好的效果[20-21]。本研究中利福平的耐药率为97.06%,与Lin等[17]的79.0%相近,高于Zhao等[18]的21.2%,这可能与采取的临界质量浓度不同有关。本研究使用预制的药敏板,利福平的耐药临界质量浓度为2 mg/L,而Zhao等[18]用的临界质量浓度为8 mg/L。本研究中利福布汀的耐药率为5.88%,与肖士林等[22]的4.6%相当;甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的耐药率为8.82%,远低于Song等[23]的39.29%。由于不同菌株耐药性差异较大,因此治疗前需进行药敏试验,为临床治疗提供必要的支持。

本研究对68株进行了VNTR分型分析,结果表明,位点VNTR 7、12、13的h>0.500。王淑琦等[16]的研究中VNTR 7、11～13及15的h>0.500;Zhao等[18]的研究中VNTR 4、5、7、10、11、15和16的h>0.500;Zheng等[24]报道,除了VNTR 7和11外,其他位点的h>0.500;Lari等[25]的研究显示位点VNTR 2、3、4、5、7、9、10和13的h>0.500。这表明各地菌株构成遗传特异性有较大的差异。

本研究68株胞内分枝杆菌临床分离株被分为45个基因型,包括来自11个簇的34个菌株和34个独特模式的分离株。胞内分枝杆菌分离株VNTR分型的HGDI值为0.978,与Zheng等[24]的0.995和Lari等[25]的0.993相当,表明分型方法具有较高的分辨力。与Lari等[25]的结果不同,本研究中最小生成树仅由一个53株菌的大簇构成,表明各地的胞内分枝杆菌菌株的多样性存在差异。利奈唑胺和阿米卡星耐药率在成簇菌株中高于非成簇菌株。Zhao等[18]报道莫西沙星耐药率在成簇菌株中高于非成簇菌株;Zheng等[24]的研究表明左氧氟沙星非成簇菌株对的耐药性高于成簇菌株;而王淑琦等[16]的研究结果显示成簇菌株与非成簇菌株耐药率没有差异。

综上,本研究结果表明,克拉霉素、利福布汀和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑等对河南省胞内分枝杆菌临床分离株具有较好的抗菌活性,VNTR分型方法对胞内分枝杆菌临床分离株具有较好的分型能力,成簇菌株对利奈唑胺和阿米卡星的耐药率高于未成簇菌株。