超声造影联合血清SMURF1 检测诊断甲状腺癌的临床分析

汪 金,常 新,韩春荣,万 珂,谌 辉,赵 静,熊 鹃 （. 东南大学附属中大医院溧水分院/南京市溧水区人民医院超声医学科，江苏 南京 00；. 东南大学附属中大医院溧水分院/南京市溧水区人民医院病理科，江苏 南京 00；. 悉尼大学医学与健康学院，澳大利亚 新南威尔士 050）

甲状腺癌常见于人体，发病率不断升高[1]。超声造影（contrast-enhanced ultrasound,CEUS）、穿刺及CT等早期诊断技术广泛应用于甲状腺癌的诊断，但准确度均有待提高[2-3]。甲状腺癌进展慢，预后通常良好，但其引发的各种并发症会影响患者身心健康[4]。尽早筛查出甲状腺癌，并给予相应治疗，能最大限度减轻疾病对患者的影响，因此有必要寻找敏感、准确的筛查手段。甲状腺细胞癌变过程涉及多种因素，如基因的激活和失活、DNA的甲基化和突变、细胞内通路的刺激等[5]。Smad泛素调节因子1（Smad ubiquitin regulatory factor 1，SMURF1）是一种C2-WW-HECT 泛素连接酶，属于Nedd4 家族，在神经系统、骨骼、肺和生殖器官等多个组织中表达[6]，参与病毒自噬、胚胎发生、骨稳态调控等多种生物学过程[7]。SMURF1 已被证明在多种癌症中发挥致癌作用，可促进肿瘤细胞增殖、迁移和上皮- 间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[8-9]。有研究发现，SMURF1 在甲状腺癌组织中高表达，可促进甲状腺癌的形成和发展[10]。本研究检测了SMURF1 在甲状腺癌患者血清中的表达水平，并分析超声造影参数联合血清SMURF1检测对甲状腺癌的诊断价值，以期为甲状腺癌的临床诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择东南大学附属中大医院溧水分院2019 年2月至2020年2月收治的144例TI-RADS4类结节患者为研究对象。根据组织病理学结果，将患者分为甲状腺癌组（76 例）和良性组（68 例）。甲状腺癌组中男36 例，女40 例；年龄（48.67±8.16）岁；病程（3.52±1.04）年；病灶：左侧29 例、右侧34 例、双侧6 例、峡部7 例；病理类型：乳头状癌66 例，混合癌2 例，髓样癌2 例，滤泡癌3 例，未分化癌3 例。不同病理类型患者血清SMURF1 mRNA 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。良性组中男34 例，女34 例；年龄（50.42±7.65）岁；病程（3.18±0.79）年；病灶：左侧25 例、右侧31 例、双侧5 例、峡部7 例；病理类型：甲状腺瘤36 例，结节性甲状腺肿27 例，桥本氏甲状腺炎5 例。纳入标准：①手术及甲状腺功能资料基本完整，不影响试验；②确诊甲状腺癌，且均为1枚结节。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并糖尿病、高血压、肺结核等；③严重器官功能衰竭；④心、脑血管疾病。2 组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经东南大学附属中大医院溧水分院医学伦理委员会批准（2018-12-048），患者及家属均知情并签署同意书。

1.2 超声造影检查

由同一医师使用彩色多普勒超声诊断仪（Resona 8 型，探头型号为L11-3U，探头频率为3～11 MHz）对所有患者进行检查。经肘静脉推注1.5 mL造影剂，然后快速注射5.0 mL 生理盐水冲洗，记录超声造影图像。注意检查过程中不得有吞咽动作，探头于肿块切面最大处固定，采集时间＞2 min。所得图像均导入Qontrast 4.0 软件进行分析，得出达峰时间（time to peak,TTP）、造影剂平均通过时间（mean transit time,MTT）、峰值强度（peak intensity,PI）、平均灌注强度（mean perfusion intensity,SImean）及最大灌注强度（maximum perfusion intensity,SImax）。

1.3 qRT-PCR法检测血清SMURF1 mRNA表达

收集患者行超声造影前的空腹外周血4～5 mL，静置35～45 min，4 ℃下以4 200 r/min 离心10 min，分离血清，-70 ℃保存。解冻血清，利用TRIzol LS Reagent 提取总RNA；采用First-Strand cDNA Synthesis Kit 将RNA反转录为cDNA；使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix、qRT-PCR 仪扩增cDNA，获取循环阈值（Ct 值）。SMURF1 引物上游序列为5′-ACTCGGGACATACCT GCTCT-3′，下游序列为5′-GCCCTAGGGGAGTGACT ACA-3′，GAPDH 为SMURF1 的内参基因，以2-ΔΔCt法计算SMURF1 mRNA相对表达量。

1.4 评价指标

以手术切除病灶甲状腺病理结果为金标准，以超声造影所得PI、SImean 及SImax 为自变量绘制受试者工作特征（receiver operating characteristica,ROC）曲线，评估超声造影对甲状腺癌的诊断价值；以血清SMURF1 为自变量绘制ROC曲线，评估SMURF1 检测对甲状腺癌的诊断价值；以超声造影准确度最高的参数SImax＜57.90 或血清SMURF1 mRNA＞1.42 为甲状腺癌阳性，采用并联方式诊断，四格表分析超声造影参数联合SMURF1检测对甲状腺癌的诊断价值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件分析数据。计数资料以率（%）表示，行χ2检验；计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（）表示，行独立样本t检验；以病理结果为金标准，以四格表/ROC曲线分析超声造影、血清SMURF1 及二者联合对甲状腺癌的诊断价值。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清SMURF1 mRNA 水平和超声造影参数比较

甲状腺癌组超声造影参数PI、SImean、SImax 均低于良性组（P＜0.05），SMURF1 mRNA 水平高于良性组（P＜0.05）；2 组患者TTP、MTT 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 血清SMURF1 mRNA水平和超声造影参数比较

2.2 超声造影对甲状腺癌的诊断价值分析

ROC结果显示，PI、SImean、SImax诊断甲状腺癌的曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为0.737、0.720、0.813，最佳截断值分别为42.08、45.86、57.90，敏感度分别为75.00%、84.21%、82.89%，特异度分别为66.18%、55.88%、72.06%，准确度分别为70.83%、70.83%、77.78%，见图1。SImax的AUC及准确度均显著高于PI、SImean（P＜0.05）。

图1 PI、SImean、SImax诊断甲状腺癌的ROC曲线

2.3 SMURF1对甲状腺癌的诊断价值分析

ROC曲线显示，SMURF1 诊断甲状腺癌的AUC为0.824（95%CI：0.828～0.937），截断值为1.42，敏感度为65.79%，特异度为94.12%，准确度为79.17%，见图2。

图2 血清SMURF1诊断甲状腺癌的ROC曲线

2.4 SImax、SMURF1诊断与病理学诊断的一致性比较

超声造影参数SImax、SMURF1与病理诊断结果一致性均中等（P＜0.05），SImax 联合血清SMURF1 检测与病理诊断结果一致性较高（P＜0.05），见表2。

表2 SImax、SMURF1诊断与病理学诊断的一致性比较

2.5 SImax联合SMURF1对甲状腺癌的诊断价值

SImax 联合SMURF1 诊断甲状腺癌的敏感度和准确度均高于SImax、SMURF1 单独诊断（P＜0.05）；且二者联合预测预后的AUC为0.927，明显高于二者单独诊断（Z联合vs.SImax=3.999，P＜0.001；Z联合vs.SMURF1=3.270，P=0.001），见表3、图3。

图3 SImax联合血清SMURF1诊断甲状腺癌的ROC曲线

表3 超声造影参数SImax联合血清SMURF1 mRNA诊断甲状腺癌的价值

3 讨论

目前，临床上疑似甲状腺癌患者以穿刺和超声为主要诊断手段，其中穿刺属于有创检查，且会出现假阴和假阳情况，而超声可在一定程度上提高甲状腺癌的检出率，但其较低的特异度可能使检查结果出现过度诊断情况，从而导致过度治疗[11]。因此，本研究将血清SMURF1 与超声造影参数联合用于甲状腺癌的诊断，以期提高甲状腺癌的诊断准确率，降低过度诊断、过度治疗等的发生率。

超声造影需要静脉注射造影剂，通过此种诊断探得病灶时间-强度曲线，并依靠得到的曲线情况判断灌注情况[12]。其中TTP、MTT、PI、SImean 及SImax 均为重要参数，甲状腺癌患者的曲线特征为TTP、MTT 短，快出慢进低增强[13]。甲状腺癌细胞的侵袭和转移均与微血管形成密切相关，而超声造影参数与微血管密度有关，其诊断肿瘤血管的价值较高[14]，因此，推测超声造影参数诊断可能适用于甲状腺癌的诊断。本研究中，甲状腺癌组超声造影参数PI、SImean、SImax均低于良性组，与黄莺等[15]的研究结果一致。王春梅等[16]研究表明，TTP、MTT 与甲状腺癌细胞增殖及淋巴结转移等有关，可以反映甲状腺癌细胞活性；李梅等[17]发现甲状腺癌患者的超声造影特征参数TTP、MTT 明显高于良性患者，本研究结果与之不符。究其原因，可能与甲状腺癌患者机体血管数量及不规则分支较多但分布不均、管网杂乱有关[18]，TTP、MTT 在甲状腺良性、恶性病变机体中的差异可能不一致。另有研究表明，SImax 与微血管的密度相关性最高[13]。本研究结果显示，超声造影参数SImax 对甲状腺癌的诊断价值最高，AUC为0.813，敏感度为82.89%，特异度为72.06%，准确度为77.78%，提示超声造影参数SImax对甲状腺癌具有较高的诊断价值，但其敏感度和准确度仍待提高。

SMURF1可在底物蛋白上添加单个或多个泛素分子来触发蛋白质的泛素化降解，参与细胞增殖等多种过程的调控，进而影响肿瘤进展[10]。SMURF1 在大多数肿瘤中被认为是致癌基因，可促进肿瘤侵袭和转移，导致肿瘤进展和预后不良[19]。有研究显示，靶向SMURF1 和/或阻断SMURF1 表达，降低其泛素化活性，有利于抑癌蛋白的稳定，抑制肿瘤进展[10]。Bian[20]的研究表明，SMURF1在甲状腺癌血清中异常高表达。本研究结果显示，甲状腺癌组血清SMURF1 水平显著高于良性组，SMURF1 诊断甲状腺癌的AUC为0.824，敏感度为65.79%，特异度为94.12%，准确度为79.17%，对甲状腺癌有较高诊断价值，但敏感度较低，与上述研究一致，说明SMURF1 单独诊断甲状腺癌具有局限性。

近年来，影像学与血清因子联合用于疾病评估的研究越来越多，影像学敏感度较好，血清指标具有较高特异度，二者联合使用可提高甲状腺癌的诊断准确度。有研究报道，超声造影联合球蛋白对于甲状腺癌术前N 分期的预测具有较高价值[21]；超声造影联合血清TSHR对老年甲状腺癌的诊断准确度为87.80%，高于超声造影和血清TSHR单独诊断[15]。本研究中，SImax联合血清SMURF1 用于疾病评估的准确度高于单独诊断，提示二者联合诊断弥补了超声造影、SMURF1单独诊断的不足，降低了临床高度怀疑而难以确诊的甲状腺癌患者的误诊率，具有较高应用价值。

综上，超声造影联合血清SMURF1 检测能有效提高甲状腺癌的诊断效能，可在保证甲状腺癌患者有效诊断的前提下，避免临床甲状腺癌患者的过度治疗。但本研究样本量较少且缺乏患者随访基本资料，未对超声造影联合血清SMURF1 与甲状腺癌复发、预后的关系进行深入研究，后续将加大样本量进一步研究。