基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和网络药理学探讨尖尾芋抗乳腺癌药效物质及作用机制

王鹏 陈娅 彭江丽 彭求贤

〔摘要〕 目的 利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術和网络药理学探讨尖尾芋抗乳腺癌物质基础及作用机制。方法 结合MassBank等数据库及现有文献研究，鉴定尖尾芋醇提物的化学成分，通过TCMSP、GeneCards等数据库筛选尖尾芋抗乳腺癌的作用靶点，使用STRING数据库和Cytoscape 3.9.0构建关键靶点蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）网络；通过DAVID数据库对关键靶点进行基因本体论（gene ontology， GO）功能与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）信号通路富集分析，最后借助Cytoscape 3.9.0构建“成分-基因-通路”互作网络图。结果 从尖尾芋醇提物中共鉴定18个成分，包括生物碱类（1，3，10，12）、苯丙素类（2，8，18）、黄酮类（6，7，9，11，15）等；基于鉴定出的化合物通过网络药理学得到429个潜在作用靶点；PPI分析发现PIK3CA、PIK3R1、MAPK1等10个核心靶点，富集分析发现核心靶点可能通过调控癌症通路发挥抗乳腺癌作用，“成分-基因-通路”互作网络图显示生物碱类成分小檗碱及黄酮类成分山柰酚、木犀草素可能是尖尾芋醇提物发挥药效的主要活性成分，其机制与凋亡相关。结论 本研究初步探究了尖尾芋醇提物抗乳腺癌活性成分为生物碱及黄酮类成分，其作用机制与细胞凋亡相关，为进一步开展尖尾芋醇提物抗乳腺癌的药效物质基础及作用机制研究提供了新的思路和线索。

〔关键词〕 尖尾芋醇提物；抗乳腺癌；超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱；网络药理学；相互作用；富集分析

〔中图分类号〕R285.5         〔文献标志码〕A          〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.012

Anti-breast cancer pharmacodynamic substances and mechanism of

action of Alocasia cucullata based on UPLC-Q-TOF-MS/MS and

network pharmacology

WANG Peng1，2， CHEN Ya1，2， PENG Jiangli1，3， PENG Qiuxian1，2*

1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Engineering Technology Research Center for Bioactive Substance Discovery of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the material basis and mechanism of action of Alocasia cucullata against breast cancer by UPLC-Q-TOF-MS/MS technology and network pharmacology strategies. Methods Combined with MassBank and other databases as well as existing literature research， the chemical constituents of the ethanol extract of Alocasia cucullata were identified. The anti-breast cancer targets of Alocasia cucullata were screened by TCMSP， GeneCards， and other databases. And the protein-protein interaction （PPI） network of key targets was constructed using STRING database and Cytoscape 3.9.0. Then， GO and KEGG enrichment analyses of key targets were performed by DAVID database. Finally， the interaction network of "component-gene-pathway" was constructed by Cytoscape 3.9.0. Results A total of 18 components were identified from the ethanol extract of Alocasia cucullata， including alkaloids （1， 3， 10， 12）， phenylpropanoids （2， 8， 18）， and flavonoids （6， 7， 9， 11， 15）， etc. Based on the identified compounds， 429 potential targets were obtained by network pharmacology. In addition， ten core targets such as PIK3CA， PIK3R1， and MAPK1 were found by PPI analysis. Enrichment analysis revealed that these core targets may exert anti-breast cancer effects by regulating cancer pathways. Moreover， the interaction network of "component-gene-pathway" showed that the alkaloid component berberine and the flavonoid components kaempferol and luteolin may be the main active components of the ethanol extract of Alocasia cucullata responsible for pharmacological effects， and their mechanism was related to apoptosis. Conclusion This study preliminarily explored that the anti-breast cancer active components of the ethanol extract of Alocasia cucullata were alkaloids and flavonoids， and their mechanism of action was related to apoptosis， which provides new ideas and clues for further research on the material basis and mechanism of action of the ethanol extract of Alocasia cucullata against breast cancer.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 ethanol extract of Alocasia cucullata; anti-breast cancer; UPLC-Q-TOF-MS/MS; network pharmacology; interaction; enrichment analysis

尖尾芋，又名卜芥，为天南星科海芋属植物尖尾芋Alocasia cucullata（Lour.）Schott的根茎。在中国尖尾芋主产于福建、广西、广东、四川及贵州等海拔2 000米以下地区，尖尾芋最早记载于《广西实用中草药新选》，味辛、微苦，性寒，有毒，归肺经，具有清热解毒、消肿镇痛的功效[1-2]。现代研究表明，尖尾芋水提物和醇提物具有显著的抗肿瘤活性[3-6]，尖尾芋水提物通过免疫增强抗乳腺癌的物质基础与其所含多糖有关[3]，但尖尾芋醇提物通过诱导乳腺癌细胞凋亡的药效物质基础研究比较薄弱，其抗乳腺癌活性成分尚不明确[4]。因此，本研究主要采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术深入解析尖尾芋醇提物的化学组成，并运用网络药理学探究尖尾芋醇提物抗乳腺癌的核心活性成分、核心靶点及作用机制，以期为尖尾芋的深入研究及开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1  尖尾芋醇提物化学成分分析

1.1.1  色谱条件和质谱条件  色谱条件：色谱柱ACQUTTY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A（0.1%甲酸水），流动相B（纯乙腈），梯度洗脱（0～2 min，95% A；2～12 min，95%～70% A；12～22 min，70%～0% A；22～25 min，0% A），进样量1 μL，以0.3 mL/min流速进行梯度洗脱，柱温为30 ℃。

质谱条件：使用正、负离子2种模式进行检测，设定锥孔电压30 V，毛细管电压1.0 kV，离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度100 ℃，脱溶剂气体流速50 L/h。采集方式为MSE，采集时间25 min。分子量扫描范围为m/z 100～1 500，碰撞能量为40～60 V，碰撞气体为高纯氩气。使用亮氨酸脑啡呔进行准确质量数实时校正。

1.1.2  尖尾芋醇提物样品溶液的制备  尖尾芋于2020年11月购于广西钦州，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为天南星科海芋属植物尖尾芋Alocasia cucullata（Lour.）Schott。精密称取尖尾芋粉末1 g，用20 mL 70%甲醇回流提取2次，每次2 h。用布氏漏斗抽滤，合并滤液，减压浓缩成浸膏，将浸膏转移至10 mL容量瓶中并加入甲醇，定容至刻度，超声20 min，10 000 r/min离心10 min，离心半径13.5 cm，取上清液，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得尖尾芋醇提物样品溶液。

1.1.3  尖尾芋醇提物的化学成分鉴定  采用全扫描-动态排除和数据依赖性扫描（DDA），基于Acquity超高效液相色谱串联四极杆/飞行时间质谱对尖尾芋醇提物中的化学成分進行检测和数据采集。采用 MassLynx V4.1软件提取总离子流色谱图，获取化学成分的保留时间、质谱准分子离子峰和碎片离子峰等信息，参考Chemspider、MassBank、MoNA和HMDB数据库和相关文献，推测总结不同类别化合物及其质谱裂解规律。

1.2  尖尾芋醇提物网络药理学分析

1.2.1  作用靶点预测  利用TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、Swiss数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）查询UPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定尖尾芋醇提物化合物所对应的靶点，同时通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）查询靶点对应的基因名，选择物种为“Homo sapiens”，建立数据集，将靶点蛋白名称对应Uniprot数据集统一转换为基因名。检索GeneCards在线数据库（https：//www.genecards.org/），选择“breast cancer”为关键词，获得与抗乳腺癌相关靶点的数据集。使用Venny 2.1.0，提取单体化合物与疾病交集靶点作为尖尾芋抗乳腺癌的潜在作用靶点。

1.2.2  蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction， PPI）网络的构建  将尖尾芋醇提物化学成分抗乳腺癌的潜在作用靶点导入STRING在线数据库（STRING： functional protein association networks （string-db.org））获取PPI网络，选择物种为“Homo sapiens”，置信度设置为0.400，使用Cytoscape 3.9.0中Cyto NCA插件中的degree值算法筛选出得分前30的潜在核心靶点，将潜在核心靶点导入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”，置信度设置为0.900，得到尖尾芋醇提物化学成分的潜在核心靶点蛋白的PPI网络。

1.2.3  尖尾芋醇提物化学成分的GO及KEGG通路富集分析  通过DAVID Bioinformatics Resources 6.8在线分析平台对尖尾芋醇提物化学成分核心靶点进行GO和KEGG富集分析。选取生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）前5个条目进行GO富集结果气泡图绘制，选取京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路前20个条目进行气泡图绘制。

1.2.4  尖尾芋醇提物“成分-靶点-通路”网络的构建  利用Cytoscape 3.9.0（https：//cytoscape.org/）软件，构建尖尾芋醇提物“成分-靶点-通路”网络，分析化合物和靶点间的度（degree）值关系，其中节点代表化学成分、靶点和信号通路，边用来连接化学成分、靶点和信号通路。

2 结果和分析

2.1  尖尾芋醇提物主要化学成分

通过UPLC-Q-TOF-MS技术分析得尖尾芋醇提物总离子流色谱图，见图1。结合Chemspider、MassBank等数据库及现有文献研究，从尖尾芋醇提物中共鉴定18个化学成分，具体信息见表1。其中包括生物碱类成分（1，3，10，12）、吲哚类成分（4，5）、黄酮类成分（6，7，9，15）、苯丙素类成分（8，18）及其他类成分（2，11，13，14，16，17），其结构式见图2。

2.2  生物碱类成分分析

从尖尾芋醇提物中鉴定出4个生物碱类成分，分别为化合物1、3、10、12。其保留时间分别为0.70 min、4.00 min、11.99 min和13.82 min。负离子模式下可见化合物1 m/z 307.154 0 [M-H]-，其二级碎片离子：m/z 239.092 2 [M-H-C4H4O]-、170.059 1 [M-H-C8H8O2]-，结合MassBank数据库信息及参考文献[7]，鉴定该化合物为长春蔓尼定（vincanidine）。在正离子模式下化合物3，准分子离子峰为m/z 348.122 4[M]+，其二级碎片离子：m/z 332.091 6 [M-CH4]+、304.096 9 [M-CO2]+，结合MassBank数据库信息及参考文献[9]，鉴定该化合物为白屈菜红碱（chelerythrine）。化合物10小檗碱（berberine）分子式为C20H18NO4，通过扫描正离子模式的一级质谱图谱得准分子离子：m/z 336.123 9 [M]+，小檗碱属于异喹啉类生物碱，此类生物碱的母核易形成稳定的大π共轭体系一般不会发生裂解，碎片离子主要以甲氧基等小分子取代基为主[25]。所以小檗碱二级特征碎片离子为m/z 321.099 7 [M-CH3]+、320.091 8 [M-CH4]+、306.077 2 [M-2CH3]+。其裂解途径见图3。在正离子模式下化合物12，准分子离子峰为m/z 295.181 5 [M+H]+，其二级碎片离子：m/z 143.072 5 [M+H-C10H16O]+，结合MassBank数据库信息及参考文献[18]，鉴定该化合物为钩吻素戊（koumidine）。

2.3  吲哚类成分分析

从尖尾芋醇提物中鉴定出2个吲哚类成分，分别为化合物4、5。其保留时间分别为4.80、4.97 min。化合物4、5在正离子模式下分别可见m/z 146.059 6 [M+H]+、m/z 118.065 4 [M+H]+。对m/z 146.059 6 [M+H]+进行MS/MS裂解分析，化合物4的质谱给出其二级碎片离子为 m/z 118.065 0 [M-CO]+，结合MassBank数据库及参考文献[10]，鉴定该化合物为3-吲哚甲醛（3-formylindole）。对m/z 118.065 4 [M+H]+进行MS/MS裂解分析，化合物5的質谱给出其二级碎片离子为 m/z 117.057 4[M]+，结合MassBank数据库及参考文献[11]，鉴定该化合物为吲哚（indole）。

2.4  黄酮类成分分析

从尖尾芋醇提物中鉴定出4个黄酮类成分，包括化合物6、7、9、15。其保留时间分别为6.44、6.87、11.50、16.87 min。化合物6、7、9在负离子模式下分别可见m/z 577.136 4 [M-H]-、m/z 285.041 3 [M-H]-、m/z 285.040 9 [M-H]-。对m/z 577.136 4 [M-H]-进行MS/MS裂解分析，化合物6的质谱给出其二级碎片离子为 m/z 425.088 7 [M-H-C8H8O3]-、289.072 2[M-H-C15H12O6]-，结合MassBank数据库及参考文献[12]，鉴定该化合物为原花青素B1（procyanidin B1）。对285.041 3 [M-H]-进行MS/MS裂解分析，化合物7的质谱给出其二级碎片离子为 m/z 184.052 3[M-H-C4H4O3]-、168.052 5 [M-H-C4H4O4]-，结合MassBank数据库及参考文献[13]，鉴定该化合物为山柰酚（kaem？鄄pferol）。对m/z 285.040 9[M-H]-进行MS/MS裂解分析，化合物9的质谱给出其二级碎片离子：m/z 151.002 8[M-C8H7O2]-、133.029 4 [M-C7H5O4]-、107.013 9 [M-C9H7O4]-均为黄酮苷元碎裂特征离子，结合Chemspider数据库及参考文献[15]，鉴定该化合物为木犀草素（luteolin）。在正离子模式下化合物15，准分子离子峰为m/z 251.106 5 [M+H]+，其二级碎片离子为m/z 135.044 3 [M+H-C9H8]+，结合MassBank数据库信息及参考文献[21]，鉴定该化合物为3'，6-dimethylflavone。

2.5  苯丙素类成分分析

从尖尾芋醇提物中鉴定出的苯丙素类成分可分为木脂素类及苯丙酸类，其中化合物8为木脂素类，化合物18为苯丙酸类。化合物8、18保留时间分别为7.23、19.91 min，在正离子模式下分别可见m/z 379.081 0 [M+H]+、m/z 165.091 8 [M+H]+，对化合物8进行MS/MS裂解分析，化合物8的质谱给出其二级碎片离子为m/z 349.070 4[M+H-CH2O]+、335.092 3 [M+H-CO2]+，结合MassBank数据库及参考文献[14]，鉴定该化合物为爵床脂素G（justicidin G）。对化合物18进行MS/MS裂解分析，化合物18的质谱给出其二级碎片离子为m/z 124.051 9[M+H-C3H5]+、109.028 4 [M+H-C3H5O]+，结合MassBank数据库及参考文献[24]，鉴定该化合物为丁香酚（eugenol）。

2.6  其他类成分分析

从尖尾醇提物中鉴定出化合物2为脂肪酸类，化合物11为蒽醌类，化合物13、17为酮类，化合物14、16为酯类。蒽醌类化合物11，通过扫描负离子模式的一级质谱图谱得准分子离子：m/z 269.045 5 [M-H]-，其二级碎片离子：m/z 240.034 8[M-H-CHO]-，结合文献[17]，鉴定该化合物为芦荟大黄素（aloe-emodin）。酮类化合物17，其通过正离子模式的一级质谱扫描图谱得准分子离子：m/z 153.127 2 [M+H]+，二级质谱的碎片离子为m/z 137.096 6 [M+H-CH4]+、109.101 7 [M+H-C2H4O]+。根据以上裂解方式，结合MoNA数据库信息及参考文献[23]，鉴定该化合物为胡薄荷酮（pulegone）。

2.7  网络药理学分析

按照上述研究方案，运用网络药理学对尖尾芋尖尾芋醇提物鉴定成分进行分析，发现尖尾芋醇提物化學成分与乳腺癌具有429个交集靶点。进一步分析得到13类成分与乳腺癌有关的30个潜在核心靶点，再将30个潜在核心靶点蛋白相互作用信息导入Cytoscape3.9.0绘制尖尾芋醇提物活性成分作用靶点蛋白相互作用网络图，如图4所示，节点大小及颜色深浅代表靶点degree值大小。

再通过DAVID Bioinformatics Resources 6.8在线分析平台对尖尾芋醇提物30个核心靶点进行GO和KEGG富集分析。获得GO条目共408条，其中GO BP有308条、GO CC有42条、GO MF有58条。分别选取BP、CC、MF前5个条目进行GO富集结果气泡图绘制，如图5所示，GO BP条目中前5条为蛋白磷酸化、胞内信号转导、细胞凋亡负调控过程、细胞衰老以及纤维母细胞正调控过程。GO CC条目中前5条为细胞溶质、细胞质、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、细胞核以及质膜细胞质侧的外源性成分。GO MF条目中前5条为蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、酶结合以及蛋白激酶结合。

共获得KEGG通路共142条，选取KEGG富集通路前20个条目进行气泡图绘制，如图6所示，前10条分别为胰腺癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、癌症通路、癌症蛋白多糖、内分泌抵抗、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、人巨细胞病毒、病毒致癌、结直肠癌以及乙型肝炎，这些通路均和癌症反应密切相关。

运用Cytoscape 3.9.0作图软件对尖尾芋醇提物13个有效成分、30个核心靶点及10条KEGG信号通路制作成分-靶点-通路互作网络图，如图7所示。成分、靶点、通路在网络图中用节点表示，两个节点间的相互作用用边表示，degree值的大小决定节点大小，从而确定中药中重要的成分及相互作用力度。尖尾芋醇提物成分中小檗碱度值最高，其次是山柰酚、木犀草素、爵床脂素G、芦荟大黄素等，而1-棕榈酸单甘油酯度值最低，这些成分中，生物碱类化合物小檗碱及黄酮类化合物山柰酚、木犀草素可能是尖尾芋醇提物发挥药效的主要活性成分。同时，尖尾芋醇提物化学成分作用靶点中，度值排名前10依次为磷酸肌醇3激酶α（PIK3CA）、磷酸肌醇3激酶调节亚基1（PIK3R1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、表皮生长因子受体（EGFR）、类固醇受体共激活因子（SRC）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、胱天蛋白酶3（CASP3）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（CDKN1A）、肿瘤蛋白（TP53），这些靶点主要集中于PI3K蛋白家族和MAPK蛋白家族，很多癌症和PI3K及MAPK蛋白家族有关。此外，KEGG通路分析也发现，尖尾芋醇提物化学成分主要通过调控癌症通路、病毒感染相关通路，从而发挥抗肿瘤、抗病毒感染功效。

3 结语

本课题组前期研究[4]发现，尖尾芋醇提物石油醚部位具有良好的抗乳腺癌活性，其机制与抑制MAPKs通路p-ERK/ERK的表达有关，但尖尾芋醇提物抗乳腺癌药效物质基础尚不明确。因此，本文采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析了尖尾芋70%乙醇提取物的18种化学成分，同时，通过网络药理学分析出尖尾芋醇提物13个抗乳腺癌活性成分（1，3，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18）及429个抗乳腺癌相关靶点，说明尖尾芋醇提物抗乳腺癌作用与其多成分、多靶点的特性有关。其中生物碱类成分小檗碱（10）及黄酮类成分山柰酚（7）、木犀草素（9）为度值排名前三的核心成分，研究表明[26-28]，这3种成分抗乳腺癌作用与其抑制MAPK、PI3K等信号通路，促进凋亡等有关。PPI网络预测得到SRC、TP53、MAPK1、MAPK3、PIK3R1 5个核心靶点，进一步通过GO生物学过程富集分析显示，尖尾芋醇提物抗乳腺癌主要涉及蛋白翻译后修饰、细胞凋亡负调控等生物过程，KEGG信号通路富集分析显示，尖尾芋醇提物抗乳腺癌作用靶点富集最多的在癌症通路，包括TP53、MAPK1、MAPK3等23个靶点蛋白，TP53是一个经典肿瘤抑制蛋白，该蛋白可以调控细胞生长、凋亡等多种生物过程[29]。而MAPK为丝氨酸/苏氨酸激酶，也可以调节程序性细胞凋亡[30]。这些靶点蛋白主要集中于PI3K蛋白家族和MAPK蛋白家族，均与细胞凋亡相关，成分-基因-通路互作网络图显示，生物碱类成分小檗碱及黄酮类成分山柰酚、木犀草素可能为尖尾芋抗乳腺癌的主要活性成分，其机制与凋亡相关。以上研究结果与本课题组前期研究的尖尾芋醇提物抗乳腺癌机制相符合。

综上，尖尾芋醇提物可能通过小檗碱、山柰酚及木犀草素等成分调控TP53、MAPK1、MAPK3等30个核心靶点蛋白，进而影响PI3K、MAPK等凋亡相关信号通路来发挥抗乳腺癌作用，提示尖尾芋醇提物抗乳腺癌作用的药效物质基础可能与其所含生物碱类及黄酮类成分有关，为后续尖尾芋醇提物抗乳腺癌药效物质基础及作用机制的进一步研究提供了理论依据。

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