天名精内生真菌的分离鉴定及抗肝癌活性研究

张艺 姚思凡 孙伍慧 欧阳琳 赵碧清 周小江

〔摘要〕 目的 對天名精内生真菌进行分离和鉴定，并从中筛选出具有抗肝癌作用的活性菌株，为寻找新的抗肝癌先导化合物提供菌株资源。方法 采用植物组织切块法和平板划线法对天名精内生真菌进行分离纯化；MTT法筛选对肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用的活性菌株，并计算活性显著内生真菌的IC50值；运用形态学鉴定和分子鉴定的方法对活性菌株进行鉴定。结果 从天名精中共分离得到60株内生真菌，其中TMJ-03、TMJ-13、TMJ-15、TMJ-23、TMJ-54为活性内生真菌，其发酵物抑制HepG2细胞增殖的IC50值分别为19.49（TMJ-C-03）、31.13（TMJ-C-13）、88.65（TMJ-C-15）、37.42（TMJ-D-23）、17.22（TMJ-D-54）、32.72（TMJ-C-54） μg·mL-1。5株活性菌株均鉴定到种，分别为Aspergillus terreus、Chaetomium globosum、Alternaria tillandsiae、Fusarium proliferatum、Alternaria arborescens。结论 首次从天名精中筛选出对HepG2细胞增殖具有抑制作用的活性内生真菌，为寻找新的抗肝癌药物提供了菌株资源。

〔关键词〕 天名精；内生真菌；分离鉴定；抗肝癌；HepG2细胞；活性菌株

〔中图分类号〕R284.1；R285.5         〔文献标志码〕A          〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.007

Isolation， identification， and anti-hepatoma activity of endophytic

fungi from Carpesium abrotanoides

ZHANG Yi1， YAO Sifan1， SUN Wuhui1， OUYANG Lin1， ZHAO Biqing1， ZHOU Xiaojiang1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Engineering Technology Research Center for Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To isolate and identify endophytic fungi from Carpesium abrotanoides and screen active strains with anti-hepatoma effects， so as to provide strain resources for the development of new anti-hepatoma lead compounds. Methods The endophytic fungi were isolated and purified from Carpesium abrotanoides by plant tissue culture and scribing method， the active strains with inhibitory effects on the proliferation of HepG2 cells were screened by MTT， and the IC50 value of the notably active endophytic fungi was calculated. Morphological and molecular identification were then applied for the identification of active strains. Results Sixty strains of endophytic fungi were isolated from Carpesium abrotanoides， among which， TMJ-03， TMJ-13， TMJ-15， TMJ-23， and TMJ-54 were active. The IC50 values of their fermentation products inhibiting the proliferation of HepG2 cells were 19.49 （TMJ-C-03）， 31.13 （TMJ-C-13）， 88.65 （TMJ-C-15）， 37.42 （TMJ-D-23）， 17.22 （TMJ-D-54）， and 32.72 （TMJ-C-54） μg·mL-1， respectively. These five active strains have been identified to species level， namely Aspergillus terreus， Chaetomium globosum， Alternaria tillandsiae， Fusarium proliferatum， and Alternaria arborescens. Conclusion The active endophytic fungi with inhibitory effects on the HepG2 cell proliferation were screened from Carpesium abrotanoides for the first time， which can provide strain resources for the development of new anti-hepatoma drugs.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Carpesium abrotanoides; endophytic fungi; isolation and identification; anti-hepatoma; HepG2 cells; active strains

内生真菌（endophytic fungi）是指在其生活史的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌[1-2]。内生真菌在与宿主植物长期协同进化过程中形成了互惠共生关系，许多内生真菌带有植物体的酶系，使得内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的次级代谢产物，具有与宿主相似的药理作用[3-4]。自STROBEL等[5]从短叶红豆杉的内生真菌Taxomyces andreanae中得到紫杉醇以来，植物内生真菌迅速被国内外研究者关注，成为研究热点，药用植物内生真菌代谢产物的多样性为寻找新颖天然活性化合物提供了有效途径[6]。

天名精为菊科植物天名精Carpesium abrotanoides L.的干燥全草。味辛，性寒，归肝、肺经，有清热解毒、散瘀止痛、止血及杀虫的功效，可用于治疗牙痛、胃溃疡、脓肿、扁桃体炎、支气管炎、细菌感染、瘀伤、肿胀、病毒感染、虫积等[7-9]。天名精含有倍半萜、倍半萜二聚体、单萜、甾醇和含氮化合物等多种成分，具有抗肿瘤、抗寄生虫、抗炎、抗氧化和抗病毒等生物活性[9-12]。目前，天名精的研究主要集中于化学成分、药理活性、临床应用等领域[13-15]，对其内生真菌多样性的研究尚未有报道。近年来从天名精中分离得到的化合物特勒内酯、2α，5α-dihydroxy-11αH-eudesma-4（15）-en-12，8β-olide、2-去氧-4-表-天人菊灵、oxoeudesm-11（13）-eno-12，8α-lactone、2，3-Dihydroaromomaticin、11（13）-去氢腋生依瓦菊素、5α-Epoxyal？鄄antolactone、Ivalin等均对HepG2细胞表现出较强的抑制作用[16-18]，根据互惠共生关系，天名精内生真菌中可能产生与天名精相同或相似的抗肝癌活性成分，为了更好地开发利用天名精内生真菌资源，本课题组对天名精内生真菌进行研究，获得抗肝癌活性菌株，旨在为将来新型抗肝癌活性成分发现和药物开发打下基础。

1 材料

1.1  药材

天名精于2021年11月采自湖南中医药大学含浦校区周边，经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江教授鉴定为菊科植物天名精C. abrotanoides L.的新鲜全草。

1.2  主要仪器与试剂

HERAcell 150i CO2細胞培养箱、ST8/ST8R高速冷冻离心机、Multiskan FC酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；SW-CJ-1C超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ATX124 电子天平（东京岛津仪器有限公司）。

青霉素-链霉素溶液（批号：WH1022C211）、HepG2专用培养基（批号：WHAA23N022）、0.25% EDTA-胰蛋白酶溶液（批号：WH2622U261）均购于武汉普诺赛生命科技有限公司；MTT噻唑蓝（批号：163880，上海陶术生物科技有限公司）；二甲基亚砜（批号：401Q0313，北京索莱宝科技有限公司）；顺铂（批号：153593，MedChemExpress公司）。

1.3  培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，纯净水1 L。PDA-抗生素培养基：PDA培养基中加青霉素使浓度为100.0 mg·mL-1。大米培养基：大米200 g，纯净水100 mL。糙米培养基：糙米80 g，纯净水120 mL。

2 方法

2.1  内生真菌的分离和纯化

取天名精新鲜植株，蒸馏水冲洗干净后，剪切成2 cm左右的片块，在超净工作台用75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3～4次，2%次氯酸钠溶液浸泡2 min，无菌水清洗5次后吸干表面水分，修剪去末端暴露组织，新切口接种于PDA-抗生素培养基平板，每板接种4～5块片，封口膜密封，28 ℃恒温培养3～7 d，待接种植物组织周围长出菌丝时，用接种环挑取新长菌丝至PDA平板，如此反复纯化直至得到单一菌株。以最后1次清洗植物的无菌水作为无菌参照，确保分离得到的菌株为天名精内生真菌。将纯化好的菌株接种至斜面培养基中，4 ℃保存。

2.2  内生真菌的发酵培养

将4 ℃保存的菌株接种至PDA平板培养基，置于28 ℃培养箱中活化7 d后，分别切块接种至不同培养基中发酵，具体如下：大米培养基接种带菌平板后，常温下静置25 d，进行发酵；糙米培养基接种带菌平板后，常温下静置40 d，进行发酵。

2.3  内生真菌发酵提取物的制备

菌株发酵结束后，加入等体积乙酸乙酯，将大米（糙米）带菌培养基捣碎，浸泡过夜，超声提取3次，每次10 min，滤过，合并滤液，减压回收乙酸乙酯，得提取物，备用。

2.4  内生真菌抑制HepG2细胞增殖活性测定

2.4.1  MTT法筛选抑制HepG2细胞增殖的活性菌株  取生长状态良好的HepG2细胞，按5×104的密度，接种于96孔板，每孔100 μL，培养箱中培养24 h后，弃去旧培养液。给药组（即120个内生真菌发酵提取物组TMJ-大米-1～TMJ-大米-60和TMJ-糙米-1～TMJ-糙米-60后续为了简便大米用D表示，糙米用C表示）加入250 μg·mL-1的天名精内生真菌发酵提取物工作液，阳性药组加入250 μg·mL-1的顺铂工作液，正常对照组加入含1% FBS的DMEM培养基，每孔100 μL，每组设5个复孔。继续培养24 h后，弃去旧培养液，每孔加100 μL MTT溶液（0.5 mg·mL-1），继续培养4 h后，避光条件下小心吸弃上清液，避免吸去紫色结晶。每孔加150 μL

DMSO，震摇10 min，于490 nm波长下，酶标仪检测各孔OD值。重复3次，计算各组抑制率，结果以均值表示。抑制率=[（正常对照组-给药组）/正常对照组]×100%

2.4.2  活性菌株抑制HepG2细胞增殖的IC50值测定  按照MTT法检测，具体操作同上。给药组加入不同浓度（0、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）含药培养基，正常对照组加入含1% FBS的DMEM培养基，每组设5个复孔，每孔100 μL。每组實验独立重复3次，取均值并绘制生长曲线，计算IC50值。

2.5  活性内生真菌的鉴定

2.5.1  形态特征  将纯化好的菌株接种在PDA培养基上，将灭菌的盖玻片以45°角斜插入培养基中制作菌丝玻片，倒置显微镜下观察菌丝、孢子形态，参考《真菌鉴定手册》对菌株类型进行初步鉴定。

2.5.2  分子生物学鉴定  采用真菌基因组提取试剂盒提取菌株DNA，用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'），ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTG？鄄ATATGC-3'）扩增，反应体系25 μL：PCR Mix 21 μL，Primer F（5p） 1 μL，Primer R（5p） 1 μL，模板2 μL。反应程序：96 ℃预变性5 min；96 ℃变性20 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序。测序片段用BLAST软件进行同源性比对，通过MEGA 7.0软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）、基于Kimura 2-parameter距离构建菌株系统发育进化树，并以自展法Bootstrap进行检验，自展次数设为1 000次。

3 结果

3.1  内生真菌的分离与活性菌株的筛选

从新鲜天名精中共分离得到60株内生真菌，分别为TMJ-1～TMJ-60，其中大米培养基中菌株TMJ-（13、15、23、51、54），糙米培养基中菌株TMJ-（2、3、6、7、13、15、23、37、40、43、51、54），对HepG2细胞有明显抑制作用（图1），这表明以上12株内生真菌为活性内生真菌。

3.2  活性菌株抑制HepG2增殖的IC50值

计算出各组的抑制率，通过Graphpad prism 8.0软件进行数据分析测出各药物的IC50值，本文仅记录活性显著的内生真菌即IC50值小于100 μg·mL-1。活性菌株各组抑制率，随药物浓度递增，抑制率变大，抑制效果越强，菌株TMJ-54的大米发酵物在质量浓度为100 μg·mL-1时抑制率最大，为94.49%。在活性菌株发酵提取物抑制HepG2细胞增殖的IC50值中，TMJ-D-54的IC50值最小，为17.22 μg·mL-1，说明TMJ-54的大米发酵物对HepG2细胞增殖的抑制能力在这5株活性菌株当中最强。详见表1。

3.3  活性内生真菌的鉴定

3.3.1  形态学鉴定

3.3.1.1  菌株TMJ-03特征  在PDA培养基上菌落边缘不整齐，呈圆形或近圆形，中心稍隆起，质地为绒毛状，淡黄色至黄褐色（图2a），背面为淡黄色（图2b）。菌丝无色，有隔（图2c），分生孢子头呈疏松放射状，黑褐色色素沉积，分生孢子梗光滑、透明，分生孢子为球形（图2d），根据以上形态学特征观察，初步鉴定为曲霉属真菌。

3.3.1.2  菌株TMJ-13特征  在PDA培养基上菌落为羊毛状或棉花状，初起白色状菌落，后来变为橄榄绿色或棕灰色（图2e），背面灰色至黑色（图2f）。两周时隐约可见白色菌落中心散布灰色或黑色子囊壳小点，反面呈棕色至棕红色。菌丝有隔，无色（图2g），子囊壳球状暗棕色至黑色，单个或聚集成团，外被各种形状的附属丝，附属丝棕色（图2h），根据以上形态学特征观察，初步鉴定为毛壳属真菌。

3.3.1.3  菌株TMJ-15特征  在PDA培养基上气生菌丝初为白色，后为灰粉色至灰色，外观绒毛状（图2i），背面橘红色后变黑色（图2j），菌丝无色、透明有隔膜，分生孢子梗直立或膝状，分支或不分支（图2k），分生孢子有的无喙，有的具柱状假喙，形状变化极大，卵形、椭圆形、倒棍棒形，表面有缢缩，淡褐色或深褐色，有横隔膜1～6个（图2l），根据以上形态学特征观察，初步鉴定为链格孢属真菌。

3.3.1.4 菌株TMJ-23特征  在PDA培养基上菌落呈圆形，菌丝白色疏松、絮状（图2m），背面黄色，略带粉色（图2n）。菌丝具隔膜，无色，小型分生孢子狭长圆形，较多（图2o），大型分生孢子，纺锤形或镰刀形，较粗壮，稍弯曲，较少（图2p），根据以上形态学特征观察，初步鉴定为镰刀属真菌。

3.3.1.5  菌株TMJ-54特征  在PDA培养基上气生菌丝初为白色，后为绿褐色至黑褐色，外观绒毛状（图2q），背面黑色（图2r），菌丝有隔膜，无色、透明，分生孢子梗直立或膝状，分支或不分支（图2s），分生孢子同TMJ-15（图2t），根据以上形态学特征观察，初步鉴定为链格孢属真菌。

3.3.2  ITS序列分析鉴定  ITS扩增序列为ITS1和ITS2，大小为600 bp左右（图3）。基于真菌的ITS序列比对结果以及构建系统进化树，对活性内生真菌进行分子鉴定。

菌株TMJ-03与Aspergillus terreus（MT530046.1）聚类在同一进化支上，ITS序列的同源性为100%，鉴定为A. terreus（图4）；菌株TMJ-13与Chaetomium globosum（MT420609.1）聚类在同一进化支上，ITS序列完全匹配，同源性为100%，鉴定为C. globosum；菌株TMJ-15与Alternaria tillandsiae（KU144925.1）聚类在同一进化支上，ITS序列的同源性为99%，鉴定为A. tillandsiae；菌株TMJ-23与Fusarium proliferatum（MK611678.1）聚类在同一进化支上，ITS序列的同源性为100%，鉴定为F. proliferatum；菌株TMJ-54与菌株Alternaria. arborescens（MT420628.1）构成一个支持力100%的分支，ITS序列的同源性为100%，鉴定为A. arborescens。经NCBI序列比对，结合形态学和分子生物学方法，初步将菌株TMJ-03鉴定为A. terreus；TMJ-13鉴定为C. globosum；TMJ-15鉴定为A.tillandsiae；TMJ-23鉴定为F. proliferatum；TMJ-54鉴定为A. arborescens。

4 讨论

本研究首次对天名精内生真菌进行系统分离培养，共得到60株内生真菌。对分离得到的60株内生真菌分别进行大米、糙米培养基发酵，采用MTT法对内生真菌发酵提取物抑制HepG2细胞增殖作用进行了筛选，最终得到5株抗肝癌活性较好的内生真菌。经鉴定5株活性内生真菌分别属于曲霉属Aspergillus、毛壳菌属Chaetomium、链格孢属Alternaria和镰刀菌属Fusarium，以上4属内生真菌，均有抗肝癌活性报道。比如，青蒿内生真菌毛壳菌属Chaetomium菌株分离得到的化合物毛壳球菌素W，具有较好的抗肝癌活性[19]。毛葡萄Vitis quinquangularis内生真菌链格孢属Alternaria菌株分离得到的化合物alterperylenol能够抑制HepG2细胞生长，并诱导其凋亡和铁死亡[20]。黄芪内生真菌曲霉属Aspergillus菌株分离得到的喜树碱能够抑制HepG2细胞生长，其IC50值为0.9 mmol·L-1[21]。Dysosma diffomis内生真菌曲霉属Aspergillus菌株发酵提取物具有较强的抗癌活性其IC50<5 μg·mL-1，利用高效液相分析发现该提取物中含有鬼臼毒素，提示该内生真菌可作为鬼臼毒素的潜在来源[22]。由此可见，本研究分离培养的天名精活性内生真菌具有抗肝癌活性成分的潜力，但其抗肝癌的具体成分还有待深入研究。

此外，本研究发现天名精内生真菌A. arborescens（TMJ-54）的大米发酵物和糙米发酵物均对HepG2细胞具有较好的抑制作用，与TMJ-54菌株同属的A. alternate L-10菌株产生的两种具有新骨架的聚酮化合物，alternatones A-B （1-2），其中alternatone A （1）对人肝癌HepG2细胞系表现出细胞毒性[23]。红树林内生真菌Alternaria sp.分离得到的3个新化合物resveratrodehydes A-C （1-3），均对HepG2细胞表现出抑制作用（IC50<50 μmol·L-1）[24]。Vitis quinquangularis内生真菌链格孢属（Alternaria sp.）真菌中分离出一对具有新骨架的对映体聚酮化合物（±）alternamgin，其中（-）alternamgin对HepG2细胞表现出一定的细胞毒性，且在一定程度上能够诱导HepG2细胞凋亡[25]。因此，推断TMJ-54菌株发酵物有可能存在新的抗肝癌活性成分，值得进一步深入研究。

综上，本研究筛选出的活性内生真菌可能为潜在的新型抗肝癌活性成分的来源，今后将对活性菌株的次生代谢产物和抗肝癌作用机制进行深入研究，以期为开发新型抗肝癌药物打下基础。

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