氮素转化菌群对牛粪好氧堆肥的保氮效果

王佳丽,王梓宇,马咏琪,唐德富,孙丽坤

(甘肃农业大学 动物科学技术学院,甘肃 兰州 730070)

随着我国畜禽饲养数量的增加和生产集约化程度的提高,畜禽粪便量与日俱增。畜禽粪便携带大量的病原菌,易腐烂和发出恶臭,若处理不当,极易引发一系列环境问题[1]。目前,畜禽粪便处理中应用最多的是好氧堆肥技术,即经过堆肥发酵,将畜禽粪便中的有机质分解、腐熟,转化为稳定的腐殖质等,从而达到资源化利用的目的。在好氧堆肥中,大量氮素以NH3的形式挥发,既造成环境污染,又损失了氮素。控制堆肥过程中的氮损失已成为当前相关研究的热点。

目前,控制氮损失的方法除了改变工艺条件、堆肥方式外,就是在堆肥过程中加入添加剂。根据添加剂的作用方式,可分为物理法和化学法两类,前者常用的添加剂包括稻草、沸石、硅胶和活性炭等,后者包括过磷酸钙、硫酸亚铁、腐殖酸等。堆肥是由各种微生物在适宜条件下共同作用完成的,因此通过加入外源微生物来调整堆肥过程的微生物结构,也可达到减少氮素损失的目的[2]。研究显示,在加快堆肥进程上,多种微生物群体共同作用的效果要显著优于单一菌种[3-4]。目前,在堆肥上应用较为广泛的微生物菌剂有EM菌剂、VITABIO微生物制剂、HM菌剂和RW促腐菌剂等[5-6]。冯明谦等[7]、王卫平等[8]的研究均发现,接种微生物可加速堆肥腐熟,提高堆肥产品质量,降低对环境的不利影响;杨延梅等[9]通过试验证实,添加外源微生物可调控堆肥过程中的氮损失;傅梓铖等[10]的试验证实,添加微生物菌剂可加快有机质降解,提高堆肥产品中的总氮含量;刘克锋等[11]发现,向粪便中添加微生物菌剂后,能明显抑制堆体中的有害菌数量,促进毒性物质分解;Zhu等[12]在添加常用的商业菌剂后发现,添加微生物菌剂可使堆肥的高温维持时间延长33%。综上,接种适宜的外源微生物可优化堆肥质量,延长堆肥高温时长,缩短堆肥周期,拓展堆肥在处理有机废弃物污染和资源化方面的应用[13-14]。在外源微生物的选择上,特定功能的微生物有助于解决相应的问题。例如：在堆肥中添加纤维素降解菌可提高纤维素降解率,促进堆体腐熟[15]。孙元烽等[16]将商品菌剂RW菌剂、BDM菌剂、JBB菌剂,和从牛、羊、马的粪便中筛选出的纤维素高效降解菌制备成复合菌剂,用于羊粪堆肥发酵,显著提高了纤维素降解效果,产品的纤维素杂质明显减少,并且升温更快,高温持续时间更长,堆体的总养分含量更高。筛选具有除臭功能的优势菌种并添加到堆肥中,可减少堆肥过程中臭气的释放。沈琦等[17]从猪粪中筛选出一株嗜热纤维素降解菌Y3-2,该菌不仅能够在高温条件下降解纤维素,而且有脱氮除硫和抑菌的除臭特性。唐建等[18]将由1株毕赤酵母属(Pichiasp.)和1株根霉属(Rhizopussp.)组成的复合生物菌剂用于堆肥,增加了堆体中的硫化细菌、反硫化细菌、氨化细菌和硝化细菌数量,加快了硫化氢和氨气的代谢转化过程,抑制了硫化氢、氨气的释放量,减少了臭气的产生。

本研究拟用牛粪中筛选分离出的除臭菌和纤维素降解菌研制适用于堆肥的复合微生物菌群,通过牛粪好氧堆肥试验,从堆肥温度、pH值、电导率、种子发芽指数(GI)、铵态氮含量、硝态氮含量、总氮含量,及堆肥过程中释放的氨气等指标的变化上,分析其应用效果,为减少堆肥过程中的氮素损失提供微生物材料和有效措施。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用的牛粪和玉米秸秆采自甘肃省临夏回族自治州广河县三甲集镇新庄坪牛羊养殖农民专业合作社。其中,牛粪的含水量为69.0%,总氮含量1.79%,总有机碳含量31.60%;玉米秸秆的含水量为25.3%,总氮含量0.46%,总有机碳含量51.06%。

试验用的微生物复合菌群由作者团队自行研制,由自行分离纯化、并经拮抗试验验证的10株氮素转化性能较好的菌株复合而成,其编号如下：EE00008、EE00009、EE00011、EE00037、EE00014、EE00075、EE00071、EE00072、EE00073、EE00074。其中,EE00008、EE00009、EE00011、EE00014在纤维素降解上较具优势,EE00072、EE00073、EE00074在除氨上较具优势,EE00037和EE00075的氨氧化性能较强,其氨气去除速率分别为33.38、38.46 mg·L-1·h-1。在这10株菌株中,EE00008的最适生长温度为50 ℃,EE00071、EE00072的最适生长温度为55 ℃,其他菌株均为37 ℃。

1.2 堆肥工艺与装置

按照一定比例将牛粪和玉米秸秆混合均匀,使其碳氮比(C/N)为25,然后将其分为对照组(CK)和接种组(T)：向接种组按照10 mL·kg-1的比例喷洒菌液,然后混合均匀;向对照组喷洒等量的无菌水作为空白对照。将两组物料分别装入堆肥装置中开始堆肥。堆肥前,两组物料的含水量均为60%,分别含有新鲜牛粪11.26 kg和玉米秸秆3.74 kg。

采用50 L(实验室规模)的密闭发酵装置(图1)进行堆肥试验。试验是在冬季进行的,为保持筒壁温度,在对照组和接种组的堆肥装置外均围上电热毯和毛毯,使其外部温度条件一致,均为35 ℃。堆肥期间采用鼓风机和人工翻堆混合的方式进行供氧,鼓风机功率为200 W,风量为2.4 m3·min-1,每天通风2次,每次通风时长1 h。

1,测温口;2,集气口;3,堆肥反应罐;4,通风孔;5,通风管;6,通风口。1, Temperature measurement port; 2, Gas collection port; 3, Composting reaction tank; 4, Ventilation holes; 5, Ventilation pipe; 6, Vents.图1 好氧堆肥反应器的示意图Fig.1 Diagram of aerobic composting reactor

1.3 测定项目与分析方法

自堆肥6 d起至堆肥30 d止,每隔1 d用TMP-1500型大气采样器(南京东迈科技仪器有限公司)采集气体样品至装有3 L 2%(体积分数)硼酸溶液的玻璃容器中,早晚各一次,每次吸收1 h,检测氨气挥发量。

分别于堆肥开始前(0 d)和堆肥10、22、40 d时,在混合均匀的堆体中采集物料样品,分别表征堆肥前期、升温期、高温期、腐熟期。每个时期采集9份样品：3份保存为鲜样,3份保存为超低温样,3份制备为风干样。采样时,在四角和中心共5个点,于深35 cm处取样混合。

将采集好的堆肥样品一部分保存于4 ℃冰箱,作为鲜样备用;另一部分直接存入-80 ℃冰箱,作为超低温样。将采集到的堆肥样品在自然环境下风干,研磨,粉碎,过100目筛,收集后保存,作为风干样。

基于五点采样法,利用地温计测定距堆体顶部25 cm深处的堆体温度,同时监测环境温度。称取20.00 g新鲜堆肥样品,添加200 mL去离子水搅动15 min,静置30 min,用PH-100A型笔式pH计(上海力辰仪器科技有限公司)测定悬浮液的pH值。称取20.00 g新鲜堆肥样品,添加200 mL去离子水于(20±1)℃振荡30 min,静置30 min后过滤,用CT-3031电导率仪(深圳市柯迪达电子有限公司)测定滤液的电导率(EC)。采用硼酸吸收-纳氏比色法测定氨气挥发量。称取20.00 g新鲜堆肥样品,置于250 mL锥形瓶中,加入2 mol·L-1的KCl溶液,振荡1 h,取出,静置澄清,吸取上清液,采用纳氏试剂比色法测定样品铵态氮含量,采用紫外分光光度法测定样品硝态氮含量。称取10.00 g新鲜堆肥样品,置于250 mL锥形瓶中,按照固液比(质量体积比)1∶10的比例加入100 mL去离子水,在25 ℃条件下,100 r·min-1振荡浸提1 h,取下静置0.5 h后,取上清液过滤,收集过滤后的浸提液,采用小青菜种子开展试验,测定种子发芽率和根长,计算GI。

1.4 数据分析

用IBM SPSS Statistics 25软件开展单因素方差分析(one-way ANOVA)和独立样本t检验,显著性水平选定为α=0.05。运用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 添加微生物菌群对牛粪堆肥温度的影响

堆肥期间,对照组和接种组的外部电热毯温度始终保持在35 ℃,室温始终在17～20 ℃。堆肥刚开始时,堆体温度与外部环境温度基本一致(图2)。随着堆肥的进行,堆体温度开始上升,对照组和接种组的堆体温度分别在堆肥18 d和14 d时上升至50 ℃以上,之后,堆体温度维持在50 ℃以上,也就是说,接种组比对照组提前4 d进入高温期。至堆肥22 d时,对照组和接种组的堆体温度同时达到最大值,分别为54.3 ℃和60.1 ℃,然后堆体温度逐渐下降,对照组和接种组的堆体温度维持在50 ℃以上的时间分别为6 d和10 d。参照GB 7959—2012《粪便无害化卫生要求》,接种组达到了堆体温度50 ℃以上,并维持10 d的无害化要求。综合分析,接种组在堆肥过程中具有明显的温度优势。

CK,不加微生物菌群的对照组;T,添加微生物菌群的接种组。下同。CK, Control group without microbes. T, Inoculation group with microbes. The same as below.图2 不同处理堆肥的温度变化Fig.2 Dynamics of temperature during composting under treatments

2.2 添加微生物菌群对牛粪堆肥pH值的影响

堆肥期间,接种组的pH值总体呈先增大后减小的趋势(图3),而对照组的pH值总体波动(先升后降再升),变化幅度相对较小。堆肥前和堆肥腐熟(堆肥 40 d)时,对照组的pH值显著高于接种组;但在堆肥的升温期(堆肥10 d)和高温期(堆肥22 d),对照组的pH值显著低于接种组。最后,在腐熟期,接种组的pH值稳定在8.10,对照组达到8.16。参照NY/T 525—2021《有机肥料》,接种组和对照组均符合pH值在5.5～8.5的要求。

同一天对照组(CK)与接种组(T)的数据点上无相同字母的表示两组差异显著(P<0.05)。下同。Dots marked without the same letters correpongding to the same date indicate signficant difference between the control group (CK) and the inoculation group (T). The same as below.图3 不同处理堆肥的pH值变化Fig.3 Dynamics of pH values during composting under treatments

2.3 添加微生物菌群对牛粪堆肥电导率的影响

堆肥过程中,对照组和接种组的EC均呈先上升后下降再上升的趋势(图4)。堆肥前,对照组和接种组的EC分别为3.55、3.42 mS·cm-1,随着堆肥的进行,两组的EC均快速上升,堆肥10 d 时,两组的EC最高,分别上升至4.66、4.36 mS·cm-1,随后快速降低,堆肥22 d后再次出现上升趋势。最终,对照组和接种组的EC分别为3.52、3.09 mS·cm-1。整个堆肥期间,对照组各次检测的EC均显著高于接种组,在堆肥结束的腐熟期,二者EC均低于相关文献提出的抑制作物生长的电导率(4 mS·cm-1)[19-21],在作物生长安全范围之内。

图4 不同处理堆肥的电导率变化Fig.4 Dynamics of electrical conductivity during composting under treatments

2.4 添加微生物菌群对牛粪堆肥氨气挥发量的影响

堆肥期间,对照组与接种组的氨气挥发量变化趋势总体一致,整体呈先上升后下降的趋势(图5)。堆肥初期,对照组与接种组的氨气挥发量无显著差异,堆肥6 d时分别为31.64、47.46 mg·cm-3·h-1。随着堆肥的进行,对照组与接种组的氨气挥发量逐渐上升,至堆肥12 d时达到最大值,分别为432.38、290.01 mg·cm-3·h-1,接种组的氨气挥发量显著低于对照组。之后,两组的氨气挥发量均开始下降,至堆肥30 d时对照组和接种组的氨气挥发量分别降至5.27 mg·cm-3·h-1和0。

图5 不同处理堆肥的氨气挥发量变化Fig.5 Dynamics of ammonia volatilisation during composting under treatments

经统计,堆肥30 d内两组处理总的氨氮挥发量分别为2 525.71、1 792.78 mg·cm-3,二者差异显著。接种组比对照组氨氮少挥发了732.93 mg·cm-3,相对减少了29.02%的氨气排放。

整体来看,堆肥期间,接种组的氨气挥发量低于对照组,表明接种自制的微生物菌群在减少堆肥期间的氨气排放方面具有明显优势。

2.5 添加微生物菌群对牛粪堆肥硝态氮含量的影响

对照组和接种组堆体的硝态氮含量在堆肥期间均呈先下降后上升的趋势(图6),堆肥10 d时,二者的硝态氮含量均降至最低点,对照组降至3.65 g·kg-1,接种组降至3.89 g·kg-1,至堆肥40 d时,对照组和接种组的硝态氮含量分别上升至4.19、4.27 g·kg-1。除堆肥40 d外,其他时期对照组和接种组堆体的硝态氮含量均差异显著。与堆肥前相比,接种组腐熟后的硝态氮含量提高了5.43%,而对照组的硝态氮含量却有所下降。

图6 不同处理堆肥的硝态氮含量变化Fig.6 Dynamics of nitrate nitrogen content during composting under treatments

2.6 添加微生物菌群对牛粪堆肥铵态氮含量的影响

堆肥过程中,对照组和接种组堆体的铵态氮含量总体均呈现先上升后下降然后趋于稳定的趋势(图7),两组相比,对照组的铵态氮含量变化较为平衡。堆肥10 d时,堆料被大量分解,接种组的铵态氮含量快速上升至最大值,显著高于对照组,随后,铵态氮含量开始下降,自接种22 d起,接种组的氨态氮含量即显著低于对照组。堆肥40 d时,接种组的铵态氮含量较初始物料降低了39.54%,对照组降低了10.13%。

图7 不同处理堆肥的铵态氮含量变化Fig.7 Dynamics of ammonia nitrogen content during composting under treatments

2.7 添加微生物菌群对牛粪堆肥总氮的影响

堆肥期间,对照组的总氮含量呈现先下降后上升再下降的趋势(图8),而接种组的总氮含量呈先下降后持续上升的趋势,两组的总氮含量始终呈现出显著差异。至堆肥40 d时,接种组和对照组的总氮含量分别为27.89、25.79 g·kg-1,分别较堆肥前升高7.1%和降低3.53%,最终接种组的总氮含量较对照组高8.14%。上述结果表明,向堆体中添加微生物菌群展现出了较明显的保氮效果。

图8 不同处理堆肥的总氮含量变化Fig.8 Dynamics of total nitrogen content during composting under treatments

2.8 添加微生物菌群对牛粪堆肥种子发芽指数的影响

堆肥期间,对照组和接种组的GI总体呈升高趋势,说明堆肥浸提液对种子发芽的抑制作用逐渐减弱(图9)。堆肥前,两个处理的种子发芽指数均在40%左右,无显著差异。堆肥40 d时,对照组和接种组的GI分别达到77.82%和86.31%,二者差异显著,说明本研究所添加的微生物菌群可以有效地促进堆肥腐熟,降低堆肥产品对植物的毒性。依照NY/T 525—2021《有机肥料》,种子发芽指数应大于70%,据此判断,二者均符合有机肥料的技术指标要求。

图9 不同处理堆肥的种子发芽指数(GI)变化Fig.9 Dynamics of seed germination index (GI) during composting under treatments

3 讨论

3.1 复合微生物菌群加速堆体物料的分解和腐熟

在堆肥中,当堆体温度处于55～60 ℃的高温时,堆体物料分解较快,当堆体温度达到55 ℃以上时,有利于杀死病原微生物;但若堆体温度高于63 ℃,堆体中微生物的活性就会被抑制[22]。本试验中,对照组与接种组堆体的最高温分别为54.3、60.1℃,接种组的堆体温度更高,有助于堆料的分解和消毒。

EC揭示物料浸提液的含盐量,可反映堆肥的质量,通常认为,EC过高会抑制作物的生长[24]。在陈赛男等[25]接种自制复合菌剂进行土霉素菌渣和玉米秸秆堆肥的研究中,接种复合菌剂组的初始EC高于对照组,但最终接种复合菌剂组的EC(2.21 mS·cm-1)低于对照组(2.57 mS·cm-1)。李赟等[26]试验发现,添加菌糠的处理组的EC小于对照组。本试验中,最终对照组和接种组的EC分别为3.52、3.09 mS·cm-1,对照组的EC显著高于接种组,均处于4.0 mS·cm-1的安全水平以下。这表明添加菌剂有利于降低堆肥中的可溶性盐含量。

GI是判断堆肥的植物毒性和腐熟度的重要参数。未完全腐熟的堆体含有植物毒性物质,如小分子有机酸、NH3、多酚等,对种子发芽具有明显抑制作用,当GI值不低于80%时,堆肥中的植物毒性已消除,可认为堆肥达到完全腐熟[27]。韩丽娜等[28]的研究表明,接种微生物菌剂组的堆肥温度高于对照组,且高温期持续时间相对较长,堆肥44 d时的GI值为78%,远高于对照组的51%,比对照组提前8 d腐熟,可明显缩短堆肥腐熟时间。马骏[29]在牛粪和玉米秸秆堆肥中添加自行筛选的高温复合菌群,接种组的高温期(>50 ℃)持续了18 d,超高温期(≥ 80 ℃)持续了5 d,在堆肥的第16天时接种组的GI值就已超过80%。陈赛男等[25]研究发现,接种复合菌剂组比对照组的腐熟时间提前了7 d,最终在堆肥末期,对照组GI为94.8%,接种复合菌剂组为107.3%,远高于本研究结果。张家桢[30]向堆肥中添加菌群后,GI值超过80%。李琬等[31]发现,利用外源微生物可以使堆肥材料的GI值增加8.9%。在本试验中,堆肥40 d时,对照组和接种组的GI分别为77.82%和86.31%,表明添加微生物菌剂在一定程度上降低了堆肥对植物的毒性,加速了堆肥腐熟。

赵欧亚等[32]研究表明,在牛粪好氧堆肥中加入微生物菌群,可加速堆体升温,堆肥3 d时堆体温度即可达到54 ℃,且高温持续时间变长,明显加速了牛粪发酵的进程。沈根祥等[33]的结果显示,加入菌群能缩短堆体的加热时间,使堆体提前2～3 d到达高温期,并使堆体的最高温度升高1～2 ℃。徐大勇等[34]同样发现,接种腐熟菌剂促进了堆肥有机物质的分解转化,堆肥进入高温期的时间提前7～10 d,高温期延长,且堆肥的腐殖酸含量得到提高。在本试验中,添加复合菌群后,堆体的最高温度较对照组升高了5.8 ℃,且高温期持续时间延长4 d。

综上,本试验自行研制的微生物复合菌群加速了有机物料的生物降解,提高了堆体的最高温度,加速了腐熟进程。

3.2 复合微生物菌群通过影响堆肥过程的氮素转化起到保氮作用

综上,由作者团队自行研制的复合微生物菌群在堆肥保氮方面效果良好,可减少堆肥过程中的氮素损失,降低氨气排放对空气造成的污染。