井穴放血对急性高原缺氧大鼠视网膜组织HIF-1α、VEGF的影响 *

常晴晴 杨 艳 洒玉萍 廖 晓

（青海大学医学院，青海 西宁 810016）

不同海拔的高原会对人体造成不同的影响。据调查［1］，人体位于1500～1800 m的环境中时，会出现非显性的生理和病理变化；而位于3000 m 以上的海拔高度时，人体可明显感受到缺氧刺激，使细胞、组织、器官均处于缺氧应激状态。其中，大脑是对缺氧最为敏感的人体组织器官，其次就是视觉系统。从组织胚胎学的角度来看，视网膜被视为中枢神经系统的延伸，二者的结构有很多相似的部分［2］。在急性缺氧条件下，可出现视盘水肿及视网膜出血；长时间处于缺氧环境当中，还可致使视网膜进一步缺血缺氧，破坏血-视网膜毛细血管屏障，最终引发高原视网膜病变（High altitude retinopathy，HAR）［3］。HAR 最早是由Singh［4］提出。研究［5，6］显示，井穴放血疗法可显著缓解急性高原缺氧所致的海马损伤以及保护脑缺血急性期的神经细胞。研究针灸对视网膜急性缺氧后视神经影响的分子机制，是运用针灸治疗急性缺氧疾病的关键切入点［7，8］。本实验建立大鼠高原缺氧模型，并采用井穴放血疗法进行提前干预，从而探讨其对急性高原缺氧的作用机制以及对急性高原缺氧大鼠防护作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组健康SD 大鼠36 只，体质量（200±20）g，来自西安交通大学动物中心［许可证号：scxk（陕）2018-001］，自然饲养2 d，自然照明，自由摄食、饮水。常规外眼及眼底检查均正常。将大鼠随机分为3 组：常氧对照组4 只、低氧模型组16 只（再分为D6、D24、D48、D72 组，每组4 只）、低氧+井穴放血干预组16 只（再分为S6、S24、S48、S72 组，每组4 只）。常氧对照组在2260 m 海拔的常氧环境里喂养（西宁），模型组给予井穴放血预处理。

1.2 主要试剂及仪器盐酸（成都市科龙化工试剂厂）、10%水合氯醛（成都市科隆化学有限公司）和4%多聚甲醛溶液（西安化学试剂厂），冰冷无菌PBS（上海远慕生物），台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），酶标仪（美谷分子仪器有限公司），封板试剂（天津市瑞金特化学品有限公司），苏木精-伊红（HE）染色液（G1005，武汉赛维尔生物科技有限公司），光学显微镜（日本尼康公司），实验动物低压氧舱（西安富康空气净化设备工程有限公司），酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司）。

1.3 干预方法井穴放血干预组：一人固定大鼠头部和尾部，另一人分别点刺大鼠双侧肢趾端的十二井穴，即手太阴肺经井穴少商、手厥阴心包经井穴中冲、手少阴心经井穴少冲、手阳明大肠经井穴商阳、手少阳三焦经井穴关冲、手太阳小肠经井穴少泽，每穴以用毫针点刺出血3～5 滴为度，每日上午定时治疗1 次，左右两侧交替进行，持续5 d。

低氧模型组与常氧对照组：2组大鼠均予同样抓取1次，但不给予放血干预，共5 d。

1.4 造模方法在第6天将低氧模型组与低氧+井穴放血干预组的大鼠移入实验动物低压模拟舱内以制备急性视网膜缺氧模型，模拟仓内海拔7000 m，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，在舱内暴露相应时间（6 h、24 h、48 h、72 h）后出舱，根据大鼠视网膜损伤判定造模成功与否。

1.5 观察指标及检测方法取材：第6 天时取材常氧对照组、低氧模型组与低氧+井穴放血干预组大鼠。于相应时间（6 h、24 h、48 h、72 h）出舱后，立即麻醉，随后取出眼球，去除玻璃体和晶状体，完整剥离视网膜，最后将视网膜一部分置于-80 ℃低温保存，用于制作匀浆液；另一部分用4%多聚甲醛溶液固定，用于制作病理切片。

ELISA 法检测：按照ELISA 检测试剂盒使用说明书进行操作：（1）解冻、匀浆、离心再保存：解冻视网膜组织，取0.2 g 于试管中，加PBS 缓冲液1.8 mL，制备视网膜组织匀浆液（10%），采用低温离心机离心15 min，转速3000 r/min，离心半径12 cm；（2）稀释与加样、温育、配液、洗涤后静置：吸取上清液，再次加入PBS 溶液进行稀释，制作成组织匀浆液，浓度为1%，用封板膜封板，恒温温育30 min，用蒸馏水稀释30 倍，取下封板膜，甩干液体后滴上洗涤剂静置，反复操作后甩干；（3）加酶、温育、洗涤、显色、终止：加入酶标试剂，温育洗涤后加入显色剂A 和显色剂B，恒温箱内避光显色15 min，加终止液 50μL，终止反应；（4）测值与计算：计算大鼠视网膜组织血清中血管内皮生长因子（VEGF）及低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的含量。

视网膜HE 染色观察：首先取片、烤片，再进行脱蜡、复水，用苏木精液染色及1%盐酸酒精分色，用流水冲洗至返蓝后镜检。接着进行脱水、透明，用中性树胶封片，最终观察结果并拍片。

1.6 统计学方法采用SPSS 26.0 统计软件处理数据，计量资料用（±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用x2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠视网膜组织病理变化比较常氧对照组大鼠视网膜组织未见明显异常，组织细胞排列规则，形态正常，各层结构完整、清晰、厚度均匀，且核仁明显，无水肿表现，视网膜神经节细胞呈密集单层排列分布，细胞核大小形状不一，核内染色质均匀分布。

低氧模型6 h 组大鼠视网膜可见神经节细胞部分轻度水肿，结构欠清楚；而24 h、48 h、72 h的3组中，大鼠视网膜的各层组织水肿，疏松明显，多见空泡变性，细胞核减少，结构层次紊乱。

低氧+井穴放血干预组相较于同时点低氧模型组，视网膜损伤较轻，但仍有不同程度损伤。见图1。

图1 各组大鼠视网膜组织病理变化（HE染色）

2.2 3 组大鼠视网膜血清VEGF、HIF-1α 含量比较与常氧对照组比较，低氧模型组大鼠的血清VEGF、HIF-1α 含量明显增加（P＜0.01）；与同时点低氧模型组比较，低氧+井穴放血干预组大鼠血清VEGF、HIF-1α 含量明显下降（P＜0.01），差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠视网膜血清VEGF、HIF-1α含量比较（±s，pg/g）

表1 各组大鼠视网膜血清VEGF、HIF-1α含量比较（±s，pg/g）

注：与常氧对照组比较，1）P＜0.01；与同时点低氧模型组比较，2）P＜0.01。

VEGF 1038.40±50.33 2521.40±296.771）2189.06±235.391）1995.53±275.971）2280.02±331.911）2018.06±214.422）1376.64±353.622）903.92±276.042）689.74±224.092）63.598＜0.001组别常氧对照组低氧模型D6组低氧模型D24组低氧模型D48组低氧模型D72组低氧+井穴放血干预S6组低氧+井穴放血干预S24组低氧+井穴放血干预S48组低氧+井穴放血干预S72组F值P值鼠数444444444 HIF-1α 357.40±50.33 615.67±60.861）548.56±40.091）562.25±56.511）629.29±55.161）515.09±53.742）458.72±48.182）393.60±46.662）395.75±47.192）44.968＜0.001

3 讨论

本研究中视网膜组织病理变化表明，在海拔7000 m的条件下暴露72 h，能够较好地建立大鼠急性视网膜缺氧损伤模型，同时显示低氧+井穴放血干预组相较于同时点低氧模型组大鼠急性视网膜缺氧损伤的程度更轻。

《医宗金鉴》中载述，针刺商阳能治疗中风、突发晕厥、头晕目眩、痰液流涎，少商、关冲和商阳等井穴能够促进气血的运行，为抢救的关键要点［9］。因井穴系阴阳经气相交之处，针刺此处可达到通调十二经之气的效果。回顾近年大量国内外关于针灸治疗缺血性脑卒中的研究［10］，发现针灸可能是通过参与缺血性脑损伤后神经结构与功能的修复与重塑，来达到治疗缺血性脑卒中的目的。视网膜被视作神经中枢系统的延伸，对缺氧刺激极为敏感，针灸的放血治疗对于缺氧所致的视网膜损伤改善效果明显［11］。

HIF-1α 是受缺氧调控的一种转录因子［12］。有研究［13］在光镜下观察各组大鼠的视网膜，发现缺氧模型组大鼠的视网膜在神经感觉层发生了水肿，以神经纤维层为著，此时大鼠神经节细胞出现肿胀且视网膜HIF的表达显著增多。本实验显示，正常大鼠视网膜血清HIF-1α、VEGF含量较低，而在模拟海拔7000 m的环境中，大鼠血清HIF-1α、VEGF 含量显著增加，且HIF-1α 与VEGF 的变化趋势基本相似，这也表明VEGF 的表达受到了HIF-1α的调控。但低氧+井穴放血干预组与同时点低氧模型组比较，大鼠的视网膜血清HIF-1α、VEGF含量显著下降，这提示井穴放血可能通过降低视网膜新生血管中VEGF的表达来抑制VEGF mRNA、HIF-1α，从而减轻缺氧对视网膜组织造成的损伤，这对急性缺氧所致的视网膜损伤有一定的保护作用。井穴放血对于视网膜HIF-1α、VEGF mRNA表达的影响仍有待进一步研究［14］。

综上所述，井穴放血对于急性缺血视网膜组织损伤有明显的保护作用，从分子机制观察，可能与降低视网膜HIF-1α、VEGF含量有关。但本实验研究仅从视网膜血清HIF-1α、VEGF含量的角度研究井穴放血对视网膜损伤的保护作用，且大鼠的样本量相对偏少，后续仍需加大样本数量，对视网膜HIF-1α、VEGF的基因表达与调控及细胞线粒体机制等方面进行深入研究，为进一步阐释井穴放血治疗急性高原缺氧的作用机制奠定良好的基础。