基于氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料的无酶型电化学免疫传感器的构建及应用

赵丽芳,于晓菲,滕龙,齐云,刘鹏飞,侯斌,张娟*

(1.山东省产品质量检验研究院,山东 济南 250100; 2.山东省环科院环境工程有限公司,山东 济南 250109;3.滨州市检验检测中心,山东 滨州 256600)

对肿瘤标志物的高灵敏度、高准确度的检测是目前癌症诊断的重要课题。该领域采用各种技术和检测方法来实现肿瘤标志物的快速、灵敏、准确的检测,包括酶联免疫吸附试验法、表面等离子体共振法、石英晶体微平衡法、各种发光和荧光技术等。然而,这些技术和方法通常需要复杂的样品处理过程,耗时长,不能满足日益增长的快速检测的需求。因此,亟需开发一个简单、可靠的技术和方法。这一需求在超低浓度的生物标志物检测方面尤为明显,如甲胎蛋白的检测。

免疫传感器以抗原或抗体作为敏感元件,能够实现传感与换能的同步进行,可以达到定量的监测,也能够实现对传感器界面反应的实时监测。免疫传感器的结构与其他生物传感器相类似,主要是由接收器、转换器和电子放大器三部分组成的[1]。免疫传感器的敏感元件是抗原、抗体,将抗原或抗体固定在载体表面用以构建敏感膜,即传感器的敏感膜[2]。抗原与抗体在敏感膜上特异性结合产生信号,这些信号被传送到转换器。通过转换器的转化将接收到的信号转化为电信号,同时进行信号的放大和数字化[3]。免疫传感器是可以将输出结果数字化的精密换能器,它在达到定量检测的同时,也能够实现传感器表面抗原-抗体反应的实时监测,这对免疫反应动力学分析是非常有利的[4]。

电化学免疫传感器则是指由抗原或抗体为敏感元件,电极作为转换元件,以电势或电流为特征检测信号的传感器[5]。目前大量的电化学免疫传感已应用在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域[6-10]。

为了构建免疫传感器,酶通常被固定在电极表面,作为催化活性位点以产生信号,在使用免疫传感器时,必须考虑到酶的实际稳定性和复杂的预处理过程。而酶的稳定性受环境影响较大,因此无酶型免疫传感器越来越受到人们的关注。

本文构建了一种新的电化学免疫传感器,能够无酶检测甲胎蛋白(AFP)。利用金@铂纳米粒子和氨基化石墨烯的作用替代传统的过氧化氢酶,进行无酶检测。本方案中,以氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子修饰电极表面,氨基化石墨烯具有良好的导电性和电催化活性,能够促进材料与电极间的电子转移,改善电极的性能;金@铂纳米粒子对过氧化氢具有高催化性能,可以实现对甲胎蛋白(AFP)的快速检测。本研究的目的是证明利用这种新颖、简单的设计,可以开发出无酶、快速、可靠的电化学免疫传感器。

1 试验部分

1.1 试剂和仪器

氯金酸(HAuCl4)、氯铂酸(H2PtCl6),均购于国药集团化学试剂(北京)有限公司。石墨粉于飞世尔科学公司购买。其他化学试剂均为分析纯或更高质量等级,均购于国药集团化学试剂(北京)有限公司。

所有电化学测量均在CHI760D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)上进行。透射电镜(TEM)由H-800透射扫描电镜(日本)获得。

1.2 氨基化石墨烯的合成

该方法采用Hummers法[11]制备氧化石墨烯(GO),然后用三聚氰胺对氧化石墨烯进行还原处理[12]。

将0.6 g的石墨粉和3.6 g高锰酸钾混合,放入带有磁子的500 mL的三口瓶中,将360 mL∶40 mL(9∶1,体积比)浓硫酸和磷酸的混合液加入以上三口瓶中,冷却至30～40 ℃,将三口瓶放入油浴,加热到50 ℃,反应12 h。反应结束,将样品倒入到40 mL的冰上,将磁子放入冰水混合物上,加入300 μL的过氧化氢,磁力搅拌0.5 h。反应结束后,得到的混合物在8 000 r·min-1的转速下离心0.5 h,然后分别用30 mL 0.2 mol·L-1的盐酸、乙醇分别离心洗涤三次,弃去上清液。最后用乙醚离心洗涤,干燥24 h,制得棕黄色固体粉末为氧化石墨烯。

称取0.15 g氧化石墨烯,加水50 mL,超声20 min得到均匀氧化石墨烯水溶液(3 mg/mL),将25 mg三聚氰胺加入至水溶液中,60 ℃油浴,搅拌反应1 h。反应结束将反应液转移至聚四氟乙烯反应釜中,200 ℃反应5 h。将反应釜冷却至室温,离心洗涤黑色反应物三次。在氩气氛围中850 ℃煅烧3 h,制得氨基化石墨烯纳米材料。

1.3 金@铂纳米粒子的制备

将1 mL 10 mg/mL PVA溶液与190 mL 0.25 mmol/L HAuCl4溶液混合,剧烈搅拌2 h后,滴加11 mL 0.1 mol/L新配制得柠檬酸三钠溶液,搅拌反应2 h,生成金胶体[13]。

将1.5 mL 20 mmol/L H2PtCl6逐滴加入到制得的金胶体溶液中,并搅拌。将10 mmol/L的抗坏血酸溶液在4 ℃条件下缓慢加入上述溶液中,混合物的颜色在几分钟内会变成黑色。加入抗坏血酸溶液后,连续搅拌30 min。将得到的溶液离心并用水洗涤三次[14]。将制备的金@铂纳米粒子分散至10 mL超纯水中,超声30 min,备用。

1.4 氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料的制备

称取3.6 mg制备的氨基化石墨烯,溶于5 mL超纯水中超声60 min后,加入2 mL金@铂纳米粒子溶液,振荡3 h,使氨基化石墨烯表面固载金@铂纳米粒子,将得到的溶液离心并用水洗涤三次。最后将氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料分散至2 mL超纯水中,超声30 min,备用。

1.5 电化学免疫传感器的制备

用Al2O3粉末抛光直径为4 mm玻碳电极,用超纯水冲洗干净电极表面。将6 μL氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料溶液滴涂在电极表面,在4 ℃条件下晾干。然后依次在电极上滴加甲胎蛋白抗体(Ab1)溶液、牛血清白蛋白(BSA)溶液、甲胎蛋白抗原(Ag)溶液,孵化4 h,并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净,即制得一种用于甲胎蛋白检测的无酶型电化学免疫传感器。

1.6 肿瘤标志物甲胎蛋白的测定

使用的电化学工作站为三电极体系,即参比电极、对电极和工作电极。在电解池中加入10 mL的磷酸盐缓冲溶液(含H2O25 mmol/L),采循环伏安法或差分脉冲法测定。

设定电位范围为-0.2～0.6 V,采用差分脉冲法测定工作电极对不同浓度的甲胎蛋白的电流响应;根据所得电流响应与甲胎蛋白溶液浓度的关系,绘制工作曲线。

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

图1氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料的透射电镜图像,显示制备的氨基化石墨烯片为单层薄片状,表面有大量的褶皱,使其比表面积增大;金@铂纳米粒子直径约为10 nm,尺寸均匀,且均匀地分散在氨基化石墨烯表面。

图1 氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料的透射电镜图

2.2 电化学免疫传感器条件的优化

在该无酶型电化学免疫传感器的构建和工作过程中,为了测试构建的无酶型电化学免疫传感器的性能,对传感器的实验条件进行优化。对于催化过程,缓冲溶液的pH值和基底材料氨基化石墨烯的浓度对检测结果都有很大的影响,其实验结果如图2所示。图2(A)中曲线表示的是在不同pH值条件下,构建的无酶型电化学免疫传感器对同一浓度的甲胎蛋白测定的结果,显示7.0为最优pH值条件;图2(B)为使用不同浓度氨基化石墨烯构建的无酶型电化学免疫传感器对同一浓度的甲胎蛋白测定的结果,氨基化石墨烯溶液质量浓度为1.8 mg/mL时,反应最为灵敏。当氨基化石墨烯浓度过低时,电子传输能力不够,同时金@铂纳米粒子负载量少,导致催化性能低,电信号放大效应不明显;氨基化石墨烯浓度过高时,在电极表面构成的导电膜过厚,阻碍电子传递,导致信号降低。

图2 (A)缓冲溶液pH值和(B)氨基化石墨烯溶液浓度对检测结果的影响

2.3 电化学免疫传感器的电化学表征

为了验证电化学免疫传感器的构建过程,使用循环伏安曲线对构建传感器过程中电极的界面结构信息进行表征,进一步说明修饰过程。图3为把不同材料滴加在玻碳电极上进行免疫传感器构建,测定各修饰过程的循环伏安曲线图,所用电解液为pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液(含H2O25 mmol/L)的溶液。

(a)氨基化石墨烯;(b)氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料;(c)氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料+Ab1;(d)氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料+Ab1+BSA;(e)氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料+Ab1+BSA+Ag。

从图中各曲线可以看出,随着电极表面的层层修饰,H2O2的氧化还原电流值相应发生变化。图中a曲线表示的是裸玻碳电极的循环伏安曲线。图中b曲线为修饰上一层氨基化石墨烯-金@铂纳米粒子复合材料的循环伏安曲线,由于氨基化石墨烯具有良好的电子传递能力,金@铂纳米粒子对H2O2具有较强的催化性能,因此氧化还原峰值电流增大。图中c曲线为修饰上一层Ab1以后的循环伏安曲线,氧化还原峰值电流较b曲线减小,原因是抗体不具有电化学活性,在一定程度上阻碍了电子的传递。接着,在已经修饰的电极表面加入BSA,封闭电极上的非特异性结合位点,图中d曲线氧化还原峰值电流值明显减小。当将甲胎蛋白抗原(AFP)固定到电极表面后的氧化还原峰值电流值(e曲线)进一步减小,这说明蛋白类阻碍电子的传递,也进一步验证了该传感器构建成功。

2.4 甲胎蛋白的电化学免疫分

在最佳条件下,随着甲胎蛋白(AFP)浓度的增加,催化电流值减小,由电流值对AFP的浓度作图,发现AFP质量浓度在0.000 1～10 pg·mL-1范围内都能呈现出良好的线性关系(图4),检出限为0.000 03 pg·mL-1(S/N=3),相关数据列于表1。

表1 工作曲线数据

图4 (A)不同浓度甲胎蛋白的检测曲线图和(B)电化学免疫传感器的工作标准曲线

2.5 甲胎蛋白电化学免疫传感器的重现性

利用无酶型电化学免疫传感器对质量浓度0.001 pg·mL的AFP进行测试,平行做5个相同浓度的同时检测,研究了构建的无酶型电化学免疫传感器的重现性(图5)。对所得数据进行计算,通过计算得到5次平行测定的相对标准偏差为3.6%,在5%以内,说明该传感器具有良好的重现性。

图5 无酶型电化学免疫传感器的重现性研究

3 结论

以氨基化石墨烯作为电极基底材料,金@铂纳米粒子替代传统的过氧化氢酶为催化因子,利用抗原-抗体的特异性免疫反应构建了无酶型电化学免疫传感器,并对其性能进行了详细研究。选用常见肿瘤标志物甲胎蛋白的模型,验证了构建的无酶型电化学免疫传感器的应用性能。该传感器具有对甲胎蛋白响应迅速、检测限较低、灵敏度高、重现性好等优点,为设计其他肿瘤标志物的无酶检测提供了一种思路。