累代遗传的肝豆状核变性的临床与基因诊断分析

刘力生， 方明娟， 年 娜， 赵 雯， 童广安， 王佳炜， 胡文彬，

肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD），又称Wilson 病，是由于ATP7B基因突变造成其编码的P 型铜转运ATP 酶缺陷引起肝铜跨膜转运障碍，使机体排铜障碍从而导致铜在肝、脑等多器官中过度蓄积，最终出现肝硬化、运动障碍、精神症状等［1］。HLD 是一种单基因常染色体隐性遗传性的、可治性的疾病，其发病率约1/30 000，人群携带率约为1/90，并具有区域差异，通常不会连续几代发病［2-4］。可能因为较高人群携带率，目前国外已有部分病例报道在同一家族内连续两代或多代中存在HLD，反映了“伪显性”遗传［5-8］。故而，2022 年美国肝病学会实践指导中明确提出对于HLD 确诊患者的一级亲属需进行ATP7B基因筛查［9］。目前国内尚无相关报道及研究，本研究针对我科近期收治的3 个累代遗传的HLD 家系进行了相关临床及基因的诊断，并进行总结分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择安徽中医药大学神经病学研究所附属医院神经内科二病区于2017 年6 月—2023 年7 月收治的HLD 患者3 例。收集调查其现病史、既往史、家族史等资料，并寻找其存在患病风险的父母、子女等一级亲属（见图1）。本研究经安徽中医药大学伦理委员会批准，取得每位参与者同意并签订知情同意书，采集家系成员的临床临检及生化指标、角膜K-F 环（kayser-fleischer ring，KFR）、腹部及头部影像学等临床资料，通过外周静脉血提取ATP7B基因检测。

图1 3个HLD家系遗传图谱

家系1：先证者（Ⅱ∶1），患者，男性，30岁，先后检查血小板减低、动作笨拙7 个月。2016 年11 月在当地医院检查发现“血小板、白细胞减低”，进一步检查腹部B超示：“肝硬化、脾肿大”，具体诊治不详。2017年2 月，家人发现其穿衣、持筷、系鞋带等精细动作笨拙，外院检查发现“血清铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CP）减低”，予以“二巯基丙磺酸钠驱铜10 余天”，上述症状略有缓解。2017 年6 月5 日首次入住我科。家族史：否认父母近亲婚配，患者儿子（Ⅲ∶1）曾因“感冒”在当地医院检查“肝功能异常”。

家系2：先证者（Ⅲ∶2），患儿，女性，3 岁，检查发现转氨酶升高、CP 减低12 d。2021 年8 月6 日患儿在幼儿园入院体检时发现“肝功能：谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）299 U/L，谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）184 U/L”，进一步检查“血清CP 0.1 g/L（参考范围0.16～0.45）；肝炎病毒学指标及自身免疫性肝炎指标均正常”，遂于2021年8月17 日入我科。家族史：否认父母近亲婚配，患儿母亲（Ⅱ∶2）及小姨（Ⅱ∶4）有不明原因转氨酶升高情况，胞兄（Ⅲ∶1）体健，未行HLD相关筛查。

家系3：先证者（Ⅰ∶2），患者，女性，54 岁，渐进性头抖、四肢抖动16 年。2007 年起先后出现头部及四肢不自主抖动。至2013 年出现行走欠稳及言语含糊，就诊北京某医院考虑“HLD”，予以“驱铜”等治疗后上述症状明显改善。2023 年4 月初，因家庭矛盾出现情绪低落、夜间入睡困难，于2023 年4月23 日入我科。家族史：否认父母近亲婚配，患者儿子（Ⅱ∶1）曾检查血清铜蓝蛋白减低，近期体检有脂肪肝。

1.2 方法

1.2.1 一般检查项目 血清学指标（ALT、AST、血清CP）使用日立7180全自动生化分析仪检测，基础24 h尿铜排泄量（尿Cu）采用火焰原子吸收光谱法，仪器为北京瑞利分析仪器公司生产WFX-120B型原子吸收分光光度计。由我院专业人员在裂隙灯（YT2A型，苏州医疗器械厂）下进行KFR检查。使用Siemens ACUSON Sequoia超声（5C1探头）检查进行腹部彩超检查；对于家系1、3 先证者使用采用Philips Achieva 1.5T MRI扫描设备进行头部影像学检查。

1.2.2 基因检测 对先证者及其诊断存在疑问的一级亲属进行ATP7B基因二代测序（next generation sequencing，NGS），所有突变位点都通过多个数据库进行评估，包括HGMD 专业版、Clinvar、gnom AD 等数据库。使用Mutation Taster 和PolyPhen-2 软件检测分析所有可能致病突变的危害性。并对所有的突变位点进行ACMG（美国医学遗传学与基因组学学会）遗传变异分类标准和指南进行分类。最后，所有可能的致病性突变都用Sanger进行了测序，并通过家族谱系进行验证。诊断方法参照2021年《中国肝豆状核变性诊治指南》［10］，并符合2001年莱比锡第8届国际HLD 会议提出的诊断标准（Leipzig计分系统）的积分 ≥ 4分［11］。

2 结 果

2.1 一般检查项目结果 家系1，Ⅱ∶1存在明显CP减低和尿Cu增高，ALT、AST正常，KFR阳性，腹部彩超提示肝硬化、脾大，头部MRI平扫提示脑干片状长T2信号，FLAIR呈稍高信号（见图2）；Ⅲ∶1仅有轻度CP减低，但尿Cu增高，ALT水平轻度升高，KFR阴性，腹部彩超未见异常，遂进一步完善基因检测。

图2 家系1的Ⅱ∶1头部MRI平扫

家系2，Ⅲ∶2、Ⅲ∶1 均有CP 减低和尿Cu 增高，KFR 均阴性。Ⅲ∶2 的ALT、AST 水平明显升高，腹部彩超提示肝内钙化灶；但Ⅲ∶1 肝功能及腹部彩超均正常，遂进一步完善基因检测，结果显示与Ⅲ∶2基因型存在差异。因Ⅱ∶2、Ⅱ∶4 曾于外院检查CP 均为0.11 g/L，且均有不明原因转氨酶增高情况，而我院CP 仅轻度减低或正常，且Ⅱ∶4 尿Cu 正常范围，KFR均阴性，故同时进行基因检测。

家系3，Ⅰ∶2 存在明显CP 减低，尿Cu 不高，肝功能指标正常，KFR 阳性，腹部彩超提示肝硬化、脾稍大，头部MRI平扫提示脑干、双侧额顶叶皮质下、双侧放射冠区可见点片状长T2信号，FLAIR 呈高信号；脑室系统稍扩张，两侧大小脑半球脑沟裂增宽（见图3）；Ⅱ∶1的CP明显减低，尿Cu高，腹部彩超提示脂肪肝，但肝功能正常，KFR 阴性，故予以完善基因检测。3个HLD家系一般检验资料（见表1）。

表1 3个HLD家系一般检验资料

图3 家系3的Ⅰ∶2头部MRI平扫

2.2 基因检测结果 3 个家系共计发现六处杂合错义突变和一处缺失突变，分别是位于14 号外显子的c. 3121C ＞ T p. Arg1041Trp、8 号外显子的c.2333G ＞ T p.Arg778Leu、12号外显子的c.2975C ＞ T p. Pro992Leu、13 号外显子的c. 2755C ＞ G p. Arg919 Gly、11号外显子的c.2605G ＞ A p.Gly869Arg和12号外显子的c.2790_2792delCAT p.Ile930del，均为已报道的HLD 常见致病位点。然而，位于2 号外显子的c. 482T ＞ C p. Ile161Thr，目前在Clinvar 数据库有收录，致病性分级为Uncertain significance，HGMD 专业版暂未收录，ACMG 致病性分析为PP3 Moderate +PM2_support+PP1_suppor，分级亦为Uncertain significance；通过PolyPhen-2、Mutation Taster 软件分析该位点危害性结果均为：0.999（见表2）。

表2 3个HLD家系ATP7B基因突变位点

2.3 3 个HLD 家系诊断结果 根据Leipzig 计分系统：家系3 中Ⅱ：1 以“CP 53.3 mg/L”“尿Cu 121.06 μg/24 h”“ATP7B基因 c. 2333G＞T p.Arg778Leu杂合突变”计算积分 ≥ 4分。最终，通过一般检查项目及ATP7B基因检测，家系1 中Ⅱ∶1、Ⅲ∶1，家系2 中Ⅲ∶2、Ⅲ∶1、Ⅱ∶2、Ⅱ∶4，家系3 中Ⅰ∶2、Ⅱ∶1 均确诊为HLD；家系2 中Ⅰ∶1、Ⅰ∶2、Ⅱ∶1、Ⅲ∶3，家系3 中Ⅰ∶1、Ⅲ∶1、Ⅲ∶2均被明确为HLD杂合突变携带者。

3 讨 论

HLD是一种由ATP7B基因突变引起的罕见的常染色体隐性遗传性铜代谢障碍性疾病［12］。1968 年，Sternlieb 和Scheinberg 首次估计了其患病率为5/100万［13］。随后的研究显示，德国每100 万人中有29 例HLD［14］，日本每100万人中有33例HLD［15］。1984年，HLD 的全球患病率估计为3.3/100 000，经推算突变携带者频率为1/90［16］。国内最早由胡文彬对安徽省部分地区进行了两次流行病学调查，得出HLD 患病率为4.93/10 万～6.21/10 万［3，17］。而对封闭/孤立人群的研究显示：希腊卡利姆诺斯岛HLD 突变携带者频率达7/100，意大利撒丁岛的HLD 患病率高达1/2 707［18］。此外，在英国的一项分子研究预测携带两个致病ATP7B等位基因的个体的频率为1/7 026，突变携带者频率高达2.4/100［19］；法国通过二代测序也发现HLD 人群杂合携带率达1/31［20］。因此，HLD 的患病率及普通人群突变携带率可能比以往认为的要高得多，当HLD 患者与杂合突变携带者婚配，这就意味着HLD 患者的一级亲属，如除兄弟姐妹外的父母、子代，患病的可能性不容忽视。

血清CP 的检测是目前临床诊断HLD 最常用的方法。根据最新Cochrane 数据库的系统评价结果显示，当以0.2 g/L 作为临界值时，CP 的敏感性为77.1%～99.0%，特异性为55.9%～82.8%；而当以0.1 g/L作为临界值时，总体的敏感性下降至65%～78.9%，但特异性提高至96.6%～100%［21］。然而，部分HLD患者的CP水平接近正常，本单位前期研究表明HLD患者CP 正常化与铜负荷过重以及肝损伤有关［22］。此外，在儿童HLD 的CP 水平研究中也发现，部分症状前期患儿CP水平是正常的［23］。本研究中，除家系1 的Ⅱ∶1 和家系3 的Ⅰ∶2 表现为典型的神经系统及肝硬化症状外，其余6例HLD 患者均为症状前期患者。其中1 例患者CP 在正常范围（16.7%），只有1 例患者CP水平低于0.1 g/L（仅占16.7%）。故而，不能单纯的以“CP 正常”便排除HLD 患者一级亲属的患病可能。

尿Cu 可以间接反映血清游离铜水平，有助于HLD 的诊断和治疗监测。当尿Cu＞100 μg/24 h 时，对诊断HLD 的敏感性为50%～80%，特异性为75.6%～98.3%；对于无症状和儿童患者，当尿Cu＞40 μg/24 h 时，对诊断HLD 的敏感性为78.9%，特异性为87.9%［21］。若能够排除其他慢性活动性肝病、肝硬化等疾病，尿Cu越高对HLD诊断价值越大。另外，尿Cu 水平会随驱铜治疗逐渐下降。本研究中，除家系3的Ⅰ∶2入院前曾进行驱铜导致尿Cu偏低外，其余患者尿Cu 均增高，符合诊断标准（100%）。因此，尿Cu测定对于筛查症状前期HLD具有较高的特异性。

根据研究显示，除胆汁淤积性肝病、部分胆道闭锁、自身免疫性肝炎等少见疾病外，KFR被广泛认为是HLD的一种特征性标志［24］。另有研究指出：在神经型HLD患者中KFR阳性率约72%～85.2%，而内脏型及症状前期患者中分别仅50%及20%～30%［25，26］。本研究结果显示，除家系1 和家系3 中的2 名先证者，亦为神经型患者的KFR 为阳性外，其余6名症状前期HLD 患者KFR 均为阴性，即阳性率为0%，因此KFR对于症状前期HLD患者的诊断敏感性较差。

目前已知的ATP7B基因致病位点达600 余种，其中以单核苷酸错义和无义突变最为常见，其次是插入/缺失，而剪接位点突变很少见［4］。在欧洲HLD患者人群中，最常见的突变为p.H1069Q［27］，而我国人群的高频致病突变依次为p. R778L，p. P992L 和p.T935M［28，29］。随着人类基因组计划的完成和基因突变数据的快速积累，研究者可以有效地利用生物信息学软件来综合预测新突变的致病性［30］。其中，PolyPhen-2 是基于进化保守性与蛋白的三维结构，利用贝叶斯分类器计算后验概率来预测［31］；Mutation Taster 是基于进化保守性、Grantham 矩阵评分、贝叶斯分类器来预测［32］；二者在灵敏度、特异性、阳性预测值、准确度等多个指标参数与其他生物信息学软件对比，表现出较好的评估性能［30］。本研究中8例HLD患者均为复合杂合突变，共发现7个突变位点，其中p.R919G出现4次（25%），其次是p.R778L、p. G869R 出现3 次（18.8%），p. P992L、p. I930del 出现2 次（12.5%），p. R1041W、p. I161T 出现1 次（6.3%）。其中除p. I161T 外均为已报道HLD 致病位点。从家系3 中Ⅱ：1 发现的p. I161T 目前仅在Clinvar 数据库有收录，但致病性分级为“Uncertain significance”，HGMD 专业版未收录，ACMG 致病性分析为“PP3 Moderate+PM2_support+PP1_suppor”，分级亦为“Uncertain significance”；通过PolyPhen-2、Mutation Taster 软件分析该位点危害性分别为“PROBABLY DAMAGING”“disease causing”，评分均为：0.999。结合该患者已有的临床数据计算Leipzig评分≥4 分，故可诊断症状前期HLD，本研究进一步证实了p.I161T突变的致病性。

HLD 的临床异质性较大，患者发病年龄可从婴儿期至70 岁以上。患者可能出现各种类型的肝病、神经精神障碍等症状，亦可无任何临床症状［33，34］。对于典型的HLD 患者，根据最新的指南进行诊断并不困难［10，35］，然而，对于部分临床表现不典型的患者，如症状前期患者，一方面，缺乏典型的肝、脑损害的症状、体征；另一方面，常规的临床指标如CP、KFR 等也可能与典型HLD 患者表现不同；这些均增加了诊断难度。有研究表明，血清转氨酶升高是儿童或症状前期HLD 诊断的重要线索［23］。本研究中，6 例症状前期患者有5 例出现不同的程度转氨酶升高情况（83.3%）。随着HLD 基因的克隆以及基因诊断技术的应用和进步，在判断临床表现和实验室检查结果不典型的HLD 疑诊患者以及有HLD 先证者的家系成员是否患病方面，基因诊断有着十分重要的价值［36］。

HLD 是一种单基因常染色体隐性遗传疾病，携带者没有任何症状，通常被认为不会发生累代遗传，然而，由于HLD 致病基因ATP7B基因突变在人群中的高携带频率，我们进行了上述研究，以展示HLD的“伪显性”遗传特征，并明确了p.Ile161Thr 突变的致病性。HLD 是一种为数不多的可治疗的遗传病，早期诊断对于确保患者能够早期接受充分的治疗、避免进展为神经型和肝硬化至关重要。临床医师可通过肝功能、CP、尿Cu 等临床指标初步评估HLD 患者父母及子女的HLD 患病风险，必要时进行基因检测明确诊断。同时，建议HLD 患者生育前对配偶进行基因检测，以避免累代遗传的发生。然而，本研究因病例数有限，研究结果可能有失偏颇，待后期继续收集案例进一步分析、验证。

伦理学声明：本研究经安徽中医药大学神经病学研究所附属医院伦理委员会批准［批号：2023伦字（27）号］，患者均签署知情同意书。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：刘力生负责论文设计、起草论文；方明娟、赵雯负责收集临床资料、绘制图表；年娜负责基因分析；童广安、王佳炜负责文献收集、拟定写作思路；胡文彬负责论文修改、指导撰写文章并最后定稿。