运用复发型胆总管结石患者胆道细菌建立豚鼠胆石症模型

卞昊宇, 韩 冉, 段学光, 姚玉璞, 吕福琪, 魏骄阳, 张立平

(1.北京中医药大学东方医院, 北京 100078 2.北京中医药大学研究生院, 北京 100029)

胆总管结石(common bile duct stones,CBDS)作为胆石症中的一类,多易合并急性化脓性胆管炎等急腹症威胁人们的生命健康。目前对于CBDS的治疗通常采用经内镜逆行胰胆管造影术(endoscopic retrograde cholangiopancreatography,ERCP)、内镜下胆道括约肌切开术(endoscopic biliary sphincterotomy,EST)等,但术后存在着较高的复发率,有研究发现ERCP术后CBDS的复发率为16.53%,复发的中位时间为10.25个月[1]。其中EST等术式会导致Oddi括约肌(sphincter of Oddi,SO)功能的部分丧失,使十二指肠细菌逆行进入患者的胆道系统,成为CBDS复发的危险因素之一。现代研究发现,除内镜操作导致胆道中出现细菌外,在本应为无菌的胆道环境中也出现了由十二指肠移位而来的细菌,并且在胆石症患者的结石中发现了细菌成分,这些均证明胆道微生物在胆石症的形成中发挥了重要作用[2]。目前基于胆道细菌感染所建立的胆石症动物模型,多采用大肠杆菌或假单胞菌属的单一菌种进行造模,造模后动物死亡率高,成石周期长,操作难度较高,且不符合临床中此类病人出现肠胆反流后的胆道微生物组成。故本研究拟使用胆道插管注射复发型CBDS患者胆道细菌的方式建立豚鼠胆石症模型,旨在探索并建立胆石症动物模型造模新方式,为今后开展探究ERCP术后CBDS复发及胆石症形成机制的相关实验研究提供可靠的实验基础。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1实验动物：普通级Dunkin Hartley豚鼠(北京市昌扬西山养殖场提供,机构许可证号：SCXK(京)2021-0008)35只,200～300g,雌雄不限。在实验室用标准豚鼠饲料喂养(由中国中医科学院中药研究所提供),适应性喂养1周后,开展ERCP术后复发型CBDS动物模型建立。实验操作均通过中国中医科学院中药研究所动物伦理审查委员会批准(2023C002、2023C003)。

1.1.2胆道细菌来源：所有胆道细菌均来自于复发型CBDS患者胆总管内胆汁,患者胆汁通过十二指肠镜收集。在十二指肠镜进镜到位后,使用20mL无菌生理盐水冲洗活检孔道及镜头先端,然后应用弓刀切开Oddi括约肌并插管,在注射造影剂前使用无菌注射器抽取胆总管内胆汁5mL后即刻分装于无菌冻存管中,用于以后的细菌高通量测序分析及细菌复苏培养。本研究通过北京中医药大学东方医院伦理委员会伦理审查,伦理审查批件号：JDF-IRB-2020031502。

1.1.3主要试剂与仪器：LB肉汤干粉(批号：20230710,规格：每瓶250g,有效期至2026年7月,生产单位：青岛海博生物技术有限公司)。琼脂粉(批号：20230225,规格：每瓶250g,有效期至2026年2月,生产单位：青岛海博生物技术有限公司)。 ED-530XT型十二指肠镜(FUJINON富士)、WSW-Thermo-1300-Ⅱ-A2型生物安全柜(赛默飞世尔苏州仪器有限公司)、MJ-01型霉菌培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)、Pannoramic 250FLASH型病理切片扫描仪(匈牙利3DHISTECH公司)、生物信息分析软件(美吉生物云)。

1.2方 法

1.2.1胆道细菌DNA扩增、文库构建及测序：胆道胆汁样本采集后立即冻存于无菌冻存管内,保存于-80℃冰箱中。基因组 DNA 提取、文库构建和测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2.2胆道细菌的复苏及培养：将LB肉汤干粉与蒸馏水按比例配置成LB肉汤液态培养基后,于高压灭菌锅(121℃,15min)中灭菌备用,待液态培养基冷却后,取无菌LB液态培养基5mL至无菌试管中。将存放于-80℃冰箱内的胆汁样本取出,使用一次性无菌微生物接种环接种50μL胆汁样本于5mL LB液态培养基的试管中,确保接种环蘸取的胆汁充分溶解于试管中。所有操作均在生物安全柜中进行。菌液接种完毕将其放置于恒温霉菌培养箱中培养。将成功复苏的胆道菌液900μL与450μL无菌60%甘油溶液混合后,留置于无菌冻存管中,冻存于-80℃冰箱中保存菌群,以待动物模型造模前制备菌液时使用。

1.2.3固态培养基的制备与菌落计数：将LB肉汤干粉、琼脂粉与蒸馏水按比例充分混合后,置于高压灭菌锅(121℃,15min)中加热灭菌,灭菌后待培养基冷却至50℃左右时,将溶液均匀倒于无菌培养皿中,等待其冷却,以制备LB肉汤固态培养基。制作平板操作均在生物安全柜中进行。固态培养基制备完毕后,使用移液枪将稀释为10-2、10-4、10-6、10-8、10-10的菌液吸取100μL分别接种在5个平板上,涂布棒涂抹均匀后将平板倒转,放置于恒温霉菌培养箱中培养过夜。直至长出菌落后计数,同时使用超微量分光光度计检测对应菌液吸光度并记录数值,结合平板菌落数对应的菌液吸光度以判断菌液中菌落浓度。(以上操作均在北京中医药大学东方医院检验科微生物实验室中进行)

1.2.4动物实验分批及处理：本次实验分两个阶段进行,第一阶段实验为胆道插管、注射复发型CBDS患者菌液后,观察动物模型长期存活率及第6、8、9周时动物胆道结石形成情况,使用的细菌从成功复苏的6名复发型CBDS患者的胆汁样本随机选择,编号为20号,胆道细菌复苏成功后继续培养12h,结合平板菌落生长情况及吸光度,本阶段造模注射菌液浓度为1.5×108cfu/mL。本阶段实验,实际建立CBDS豚鼠模型20只,实验周期9周。第二阶段实验在第一次实验的基础上增大菌液注射浓度,于造模结束后第2天起每日通过取材两只动物模型,观察胆道系统成石情况,使用的菌液来自于剩余的5名复发型CBDS患者胆汁样本中随机选择的胆汁样本,编号为17号,胆道细菌复苏成功后继续培养24h,结合平板菌落生长情况及吸光度,造模注射菌液浓度为3.5×108cfu/mL。本阶段实验,实际建立CBDS豚鼠模型14只,1只豚鼠于适应性饲养期间死亡,实验周期11d。

1.2.5ERCP术后CBDS复发模型建立方法：两阶段实验均采用胆总管插管、注射CBDS复发患者菌液的方式制备ERCP术后因肠胆反流导致胆道感染,CBDS复发动物模型。具体模型制备：动物模型制备前适应性饲养1周。术前8～12h禁食不禁水,腹腔注射3%戊巴比妥纳(40mg/kg)麻醉。右上腹正中切开3～5cm,逐层开腹直至暴露豚鼠胃及胃窦部,沿胃窦寻找十二指肠与胆总管连接处,从十二指肠大乳头对侧壁使用24G留置针穿刺十二指肠肠壁,穿刺进入十二指肠大乳头并将针尖插入胆总管中,确定留置针位于胆总管内后,向胆总管内注入菌液0.5mL并撤针,逐层缝合手术切口关腹,缝合完毕,使用碘伏消毒手术切口,并使用纱布加压包扎。术后所有动物分笼饲养,6h后普通饲料喂养,自由饮水,每日予维生素C 0.2～0.4g/L加入饮用水中,每日检查手术切口恢复情况并换药。

1.2.6样本采集：腹腔注射3%戊巴比妥纳(40mg/kg)麻醉,暴露十二指肠大乳头,24G留置针穿刺十二指肠肠壁,经十二指肠大乳头插管进入胆总管后抽取胆汁。剖取肝脏、胆囊、胆总管后,使用4%多聚甲醛溶液冲洗固定,4℃冰箱保存。

1.2.7评价检测：第一阶段实验主要评价应用胆总管插管、注射CBDS复发患者菌液的方式制备动物模型术后动物长期存活率;动物模型6周以后胆汁性状及胆道系统内结石形成情况;并留取胆汁样本做细菌培养。第二阶段实验在一阶段实验的基础上,加大注射菌液的浓度,留取动物模型的肝脏、胆囊、胆总管组织并制作石蜡切片,HE染色;观察动物模型胆汁性状及胆道系统内结石形成情况,以综合评估本实验方法建立ERCP术后CBDS复发动物模型的可行性。

2 结 果

2.1复发型CBDS患者胆道细菌组成分析：本次共采集复发型胆总管结石患者胆汁样本6例,以属水平分析物种相对丰度柱形图展示如图1。其中第一阶段实验中使用的20号胆道细菌,在属水平分类上肠球菌属(Enterococcus)占97.57%;第二阶段使用的17号胆道细菌,在属水平分类上前几位分别为肠杆菌属(Enterobacteriaceae)44.16%、拟杆菌属(Bacteroides)29.88%、肠杆菌埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)17.97%、梭菌属(Fusobacterium)3.50%、肠球菌属(Enterococcus)2.26%。见图1。

图1 复发型CBDS患者胆道细菌组成情况

2.2胆道细菌功能预测分析：根据胆道细菌组成分析可得知,两次造模使用的2个胆道细菌样本在细菌组成上具有很大的差异性,在对所有复发型CBDS患者胆道细菌做进一步的功能预测分析后发现,即使胆道细菌的种类具有显著差异,但是在能量转换和代谢、辅酶运输和代谢、脂质转运和代谢、无机离子运输和代谢等功能上,所有复发型CBDS患者的胆道细菌具有相似性。见图2。

图2 复发型CBDS患者胆道细菌功能预测分析

2.3动物模型存活率及结石产生情况：在第一阶段实验中,6周后豚鼠存活7只,存活率为35%,造模后1周内为死亡高峰,共有11只豚鼠死亡,2只于造模后第2周死亡。对死亡豚鼠进行解剖发现,1周内未皱缩排空的豚鼠胆道系统中存在少量黄色泥沙样物质。在第6、8、9周分批取材时发现所有豚鼠胆道系统内胆汁均澄清,未见明显絮状物或泥沙样结石。在第二阶段实验中,造模后第2天起每日随机选取豚鼠2只进行取材发现,所有豚鼠胆道系统中均可见散在黑色或黄色沉渣,伴或不伴脓液。通过术后第2天起至所有豚鼠死亡时止的取材过程中发现,在增大菌液浓度后,胆道系统结石形成进程加快,直至第4天时可形成完整的巨大结石,见图3。

图3 造模后第2天至第4天结石形成过程

2.4胆总管胆汁细菌培养：第一阶段实验最终存活的7只豚鼠中,其中4只胆总管抽取的胆汁细菌培养结果呈阳性3只呈阴性。7只豚鼠在取材过程中胆总管、胆囊内胆汁澄清,并未见泥沙样结石产生。

2.5肝脏、胆囊及胆总管组织结构及形态：第二阶段实验予高浓度菌液插管注射后,可见肝脏组织内胆小管周围出现明显炎性细胞浸润。胆囊及胆总管粘膜上皮柱状细胞排列整齐,组织内未见明显炎症反应,见图4、图5。

图4 肝脏组织HE染色(×20)

图5 胆囊及胆总管组织HE染色(×10)

3 讨 论

基于细菌通过肠胆反流进入胆道系统并导致结石产生的观点[3],早在上个世纪60年代,日本学者Maki就提出了著名的胆红素钙结石成因的假说[4],认为胆汁中细菌所分泌的β-Gase打破了胆红素钙沉淀生成和溶解的平衡状态,最终导致了胆色素结石的产生。在对于胆道细菌与CBDS复发及胆石症形成之间关联的进一步研究中发现,胆道细菌不仅会导致色素结石的产生,同时也会导致胆固醇类结石及混合型结石的产生[5],并且复发型CBDS患者胆道细菌的种类较非复发型患者存在明显差异[6],当患者出现了SO功能的紊乱,不仅增加了胆道中机会致病菌的种类,胆道细菌的组成较无结石的患者也出现了明显的变化[7-8]。以上研究均证实胆道细菌在CBDS的复发及胆石症的产生中发挥了重要的作用,因此探究胆道细菌与CBDS复发及胆石症间的关联,是目前临床及实验研究的重点,而建立合适的动物模型,是开展各项研究的基础。

目前胆石症动物模型大多选用兔、豚鼠及小鼠。造模方式以致石饲料喂养法、注射药物法、细菌植入法及人结石植入法等为主,结石形成的时间为1～8周不等[9]。致石饲料及注射药物法作为常见的造模方式,是从改变胆汁成分的角度产生结石。胆道细菌植入法产生结石,是基于十二指肠部位的细菌随着肠胆反流定植于胆道系统,引发胆管长期的慢性炎症,进而导致结石产生及复发的理论[10-11],但是此类造模方式常需要联合胆总管不完全梗阻以保证细菌注射后能停留在动物的胆道系统中,因而存在操作难度大,死亡率高等缺点,故实验中运用相对较少。在细菌植入法中常使用大肠杆菌,但使用大肠杆菌单一菌种造模,与临床中胆石症患者胆道细菌的组成不相符[5],无法解释为何复发型CBDS患者胆汁中的厚壁菌门等亦可成为优势菌种,所以此类造模方式,无法合理的阐释胆道微生物群与CBDS复发及胆石症之间的关系。因此,此类造模方式有待改进。

基于以上考虑,本实验尝试采用复发型CBDS患者胆道细菌作为胆道插管后注射的菌液来源。首先是基于CBDS患者的首选治疗方式为ERCP术,该术式相较于传统手术方式,获取患者胆汁更为简易,且内镜下操作具有创伤小、恢复快等优点,术中获取的胆汁样本中的细菌均由十二指肠部位移位进入胆道系统。其次,根据胆道细菌组成来看,虽然肠杆菌属在胆道细菌的组成中占有绝大部分,但胆汁主要由胆盐、胆色素、胆固醇、卵磷脂、钾、钠、钙等组成,并不符合肠杆菌属细菌生存所需要的相关生存物质。最后,考虑到当大肠杆菌进入并定植于动物的胆道系统后,需要适应胆道环境才能成功定植于胆道系统,相较于已经适应胆道环境的复发型CBDS患者胆道中的细菌,使用这类细菌并合理的控制菌液浓度进行造模,可以更好的模拟临床CBDS复发节点时的胆道微生物群,模拟结石复发及产生的过程。同时结合第一阶段动物模型胆道细菌的培养结果,存在于患者胆道中的细菌能更好的适应胆道环境,因此可以缩短模型的建立周期并提高成功率。虽然两次实验使用的细菌种类存在差异,但本研究在对多名复发型CBDS患者的胆道菌群进行功能预测分析后发现,复发型CBDS患者胆道中的优势菌种即便存在差异,但从功能预测的结果上看,不同种类的细菌,在相同的生存环境中,遵循生物进化理论,细菌的功能表现出了一定的相似性。

综上所述,通过胆道插管,胆道内注射适当浓度复发型CBDS患者胆道细菌菌液的方式制备胆石症动物模型,相较于既往使用胆道插管注射大肠杆菌联合胆道不完全梗阻的方式,成模周期短,模型成功率高,操作难度更小,动物死亡率更低,更贴合临床ERCP术后CBDS复发及胆结石产生时患者胆道的微生物组成。此类造模方式的尝试,可为更多探究胆道细菌与CBDS复发及胆石症间关联实验的开展提供基础。