金银花多酚粗提物调控miR-100-5p参与非小细胞肺癌细胞NCI-H1299侵袭迁移

申兴勇, 白 爽, 李新涛, 李亚红, 王孝彬

(1.陕西省西安市人民医院/西安市第四医院航天院区血液肿瘤中心, 陕西 西安 710004 2.陕西省肿瘤医院内二科, 陕西 西安 710061 3.空军军医大学第二附属医院/唐都医院胸外科, 陕西 西安 710038)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)为肺癌的主要亚型,占肺癌的70%～80%[1]。在中国,肺癌是发病率和死亡率较高的原发性恶性肿瘤,由于缺乏临床表现,大多数NSCLC患者入院时处于中晚期,错过了最佳治疗时机,预后并不理想[2]。近年来,中医药在NSCLC的治疗中发挥重要作用,具有增效减毒、提高生存质量、延长生存期的目的;且可预防NSCLC术后复发转移[3]。金银花(Lonicera.japonica Thunb.)是我国常用的一味传统中药,其主要有效成分可通过“多成分-多靶点-多通路”发挥抗肺癌作用[4]。据报道,四味金银花汤联合化疗治疗非小细胞肺癌疗效确切,并能延长生存期[5]。金银花多酚粗提物能够抑制肺癌H1299细胞增殖,诱导细胞凋亡[6]。然而,金银花多酚粗提物对NSCLC的影响及机制尚未明确。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)是调节NSCLC侵袭和转移的重要通路之一,研究显示,破坏Wnt/β-catenin信号传导可抑制NSCLC的侵袭和转移[7]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性单链非编码RNA,已被证实在NSCLC中存在异常表达,可通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与NSCLC细胞的增殖、侵袭与转移[8]。miR-100-5p是一种在多种癌症中表达下调的miRNA,研究显示,miR-100-5p在NSCLC组织和细胞中呈低表达,其过表达可抑制NSCLC细胞的迁移、侵袭[9]。此外,miR-100-5p可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而发挥抗癌活性[10];且金银花提取物已被证实可通过下调Wnt/β-catenin信号通路活性抑制胃肠上皮化生(胃癌恶变前病状)[11]。因此,本实验旨在研究金银花多酚粗提物对NSCLC的影响及其是否与miR-100-5p有关。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂：非小细胞肺癌NCI-H1299细胞(美国ATCC,货号：AC102184);金银花药材(河南金陵金银花药业有限公司,批号：20130521);RPMI-1640培养基(美国Gibco公司,货号： 22400-089);四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、蛋白提取试剂盒(艾美捷科技有限公司,货号：TR-100-FJT、KTP3001);Transwell小室、基质胶(美国BD公司,货号：351003、354230);Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(美国Thermo公司,货号：15596018、K1622、Q33216)。

1.2金银花多酚粗提物的制备：取100g干燥的金银花药材,研制成粉末,50℃条件下用70%甲醇浸提12h,抽滤后旋转浓缩获得粗浸膏,用甲醇溶解配置成浓度为10mg/mL的金银花多酚粗提液,于-20℃冰箱中保存备用[6]。

1.3细胞处理与分组：NCI-H1299细胞常规培养于RPMI-1640培养基中,分别用浓度为750、1500、3000 μg/mL的金银花多酚粗提物[6]分别记为金银花多酚粗提物低、中、高剂量组;常规培养的细胞作为NC组;用浓度为0.1μmoL/L紫杉醇处理,记为紫杉醇组。将miR-100-5p模拟物及阴性对照转染至NCI-H1299细胞,记为miR-100-5p组、miR-NC组;将miR-100-5p抑制剂及阴性对照分别转染至NCI-H1299细胞,然后用3000μg/mL的金银花多酚粗提物处理,记为anti-miR-100-5p+高剂量组、anti-miR-NC+高剂量组。

1.4MTT检测细胞活性：将1.3中各组细胞培养48h后分别加入20μL MTT和150μL二甲基亚砜(DMSO),反应后酶标仪检测490nm处吸光度(A)值。

1.5Transwell检测细胞迁移和侵袭：将1.3中各组细胞用无血清培养基重悬制备细胞悬液。迁移：取100 μL无血清培养的细胞液加入Transwell小室上室,培养24h,经甲醇固定、结晶紫染色后,擦掉上层未迁移细胞,显微镜下观察并记数。侵袭：用基质胶包被Transwell上室,其余按迁移实验操作。

1.6蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达：提取1.3中各组NCI-H1299细胞总蛋白,进行凝胶电泳分离蛋白,转膜、封闭后,分别加入E-Cadherin(1∶1000)、N-Cadherin(1∶1000)、Vimentin(1∶1000)、Wnt3a(1∶500)、β-catenin(1∶1000)、p-GSK-3β(1∶500)、GSK-3β(1∶1000)及内参β-actin(1∶2000)抗体于4℃孵育过夜,加入二抗(1∶2000)室温孵育2h,显影,分析蛋白条带灰度值。

1.7实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-100-5p表达水平：提取1.3中各组NCI-H1299细胞总RNA,反转录成cDNA,以U6为内参进行PCR扩增,PCR条件如下：95℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s,45个循环。miR-100-5p相对表达量采用2-△△Ct法计算。引物序列：miR-100-5p：F：5'-GAACCCGTAGATCCGAACT-3',R：5'-CAGTGCGTGTGTCGTGGAGT-3';U6：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2 结 果

2.1不同浓度金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响：与NC组比较,不同浓度金银花多酚粗提物组NCI-H1299细胞活性降低,细胞迁移和侵袭数量减少,E-Cadherin表达水平升高,N-Cadherin、Vimentin表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),紫杉醇组与高剂量组各项指标比较,差异无统计学意义(P>0.05);金银花多酚粗提物低、中、高剂量组间各项指标比较,差异有统计学意义(P<0.05),见图1,表1。

图1 不同浓度金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞迁移和侵袭的影响

表1 不同浓度金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞增殖迁移和侵袭的影响

2.2金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞中miR-100-5p表达的影响：与NC组比较,不同浓度金银花多酚粗提物组miR-100-5p表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),紫杉醇组与高剂量组各项指标比较,差异无统计学意义(P>0.05);金银花多酚粗提物低、中、高剂量组间miR-100-5p表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞中miR-100-5p表达的影响

2.3过表达miR-100-5p对NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响：与miR-NC组比较,miR-100-5p组NCI-H1299细胞中miR-100-5p表达水平升高,NCI-H1299细胞活性降低,细胞迁移和侵袭数量减少,E-Cadherin表达水平升高,N-Cadherin、Vimentin表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图2,表3。

图2 过表达miR-100-5p对NCI-H1299细胞迁移和侵袭的影响

表3 过表达miR-100-5p对NCI-H1299细胞增殖迁移和侵袭的影响

2.4下调miR-100-5p逆转金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响：与anti-miR-NC+高剂量组比较,anti-miR-100-5p+高剂量组miR-100-5p表达水平降低,NCI-H1299细胞活性升高,细胞迁移和侵袭数量增加,E-Cadherin表达水平降低,N-Cadherin、Vimentin表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图3,表4。

图3 下调miR-100-5p逆转金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞迁移和侵袭的影响

表4 下调miR-100-5p逆转金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞增殖迁移和侵袭的影响

2.5金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响：与NC组比较,金银花多酚粗提物高剂量组Wnt3a、β-catenin表达水平降低(P<0.05),p-GSK-3β/GSK-3β比值升高,差异有统计学意义(P<0.05);与anti-miR-NC+高剂量组比较,anti-miR-100-5p+高剂量组Wnt3a、β-catenin表达水平升高(P<0.05),p-GSK-3β/GSK-3β比值降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图4,表5。

图4 β-catenin蛋白表达印迹图

表5 金银花多酚粗提物及anti-miR-100-5p处理后β-catenin蛋白的表达

3 讨 论

中医药在治疗肿瘤方面具有悠久的历史,本实验用不同剂量的金银花多酚粗提物处理非小细胞肺癌NCI-H1299细胞,结果显示,NCI-H1299细胞活性降低,细胞迁移和侵袭数量减少;表明金银花多酚粗提物可抑制NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin是上皮间质转化(EMT)标志物,是NSCLC转移过程早期阶段的关键指标。金银花多酚粗提物处理后,E-Cadherin表达水平升高,N-Cadherin、Vimentin表达水平降低;表明金银花多酚粗提物可抑制NCI-H1299细胞的EMT进展。

miR-100-5p的抗癌功能已从多种来源的癌症中得到证实,已有研究表明miR-100-5p可抑制非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭[9]。本实验结果显示,过表达miR-100-5p后,NCI-H1299细胞活性降低,细胞迁移和侵袭数量减少,E-Cadherin表达水平升高,N-Cadherin、Vimentin表达水平降低;表明过表达miR-100-5p可抑制NCI-H1299细胞增殖、迁移侵袭以及EMT。中药活性成分可通过调控miRNA表达参与癌症进展,如人参皂苷Rh2可通过降低miR-28-5p表达,抑制Wnt/β-catenin信号传导来减缓NSCLC的进展[12]。在本研究中,金银花多酚粗提物可提高NCI-H1299细胞中miR-100-5p的表达水平,且下调miR-100-5p表达可逆转金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的影响;提示金银花多酚粗提物可能通过上调miR-100-5p表达抑制非小细胞肺癌NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭。

Wnt蛋白是一类富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白家族,目前已发现19种,其中Wnt3a在NSCLC中高表达,与NSCLC的发生发展相关[13];且Wnt3a可增加体外NSCLC细胞的转移潜力[14]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键因子,研究报道β-catenin在NSCLC中高表达,且与患者的浸润深度、淋巴结转移和远处器官转移相关[15]。Wnt/β-catenin未被激活时,β-catenin会被GSK-3β组成的复合物磷酸化而降解;当Wnt信号通路激活后,Wnt分泌后能与低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6共同受体(LRP5/6)结合形成细胞表面复合物,抑制GSK-3β等蛋白形成的β-catenin降解复合物的降解活性,稳定细胞质中游离状态的β-catenin蛋白,胞浆中稳定积累的β-catenin进入细胞核后参与转录调节。激活Wnt/β-catenin通路可促进NSCLC细胞恶性进展[7]。miRNA的失调是Wnt/β-catenin信号激活的关键机制之一,miR-100-5p被证实可以靶向Wnt/β-catenin信号通路的负调节因子-卷曲类受体8(FZD8)来抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活[10]。本实验结果显示,高剂量金银花多酚粗提物处理后,Wnt3a、β-catenin表达水平降低,GSK-3β的磷酸化水平升高,表明金银花多酚粗提物可抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化;而下调miR-100-5p可减弱金银花多酚粗提物对NCI-H1299细胞中Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。提示金银花多酚粗提物可能通过上调miR-100-5p表达来抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,进而抑制非小细胞肺癌NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述,金银花多酚粗提物可抑制非小细胞肺癌NCI-H1299细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与下调miR-100-5p表达,抑制Wnt/β-catenin通路活化有关。本研究为金银花多酚粗提物抑制非小细胞肺癌进展提供了重要证据,表明金银花多酚粗提物是一种潜在的治疗非小细胞肺癌的候选药物。但金银花多酚粗提物通过何种途径调节miR-100-5p表达有待进一步分析,在未来的研究中将对miR-100-5p的上游调节因子进行探索,并对Wnt/β-catenin通路进行干预,完善金银花多酚粗提物抗非小细胞肺癌的分子机制研究。