GC-MS/MS测定烟草上氟唑菌酰羟胺残留

潘 苗，于卫松，鲁世军，曹建敏，孙惠青*

GC-MS/MS测定烟草上氟唑菌酰羟胺残留

潘 苗1,2，于卫松1，鲁世军1，曹建敏1，孙惠青1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

为填补行业领域空白，本研究建立了气相色谱-串联质谱多反应监测模式（MRM）测定烟草上氟唑菌酰羟胺残留量的检测方法，并通过田间试验分析了氟唑菌酰羟胺在烟草上的消解动态。结果表明，该方法在0.001～0.5 mg/L质量浓度范围内进样浓度和响应峰面积之间的线性良好，决定系数2=0.999 5；测定RSD为4.57%，测定定量限0.012 mg/kg。在0.012、0.12和0.5 mg/kg 3个添加水平下，平均回收率在92.6%～101.7%之间，RSD在2.6%～4.5%范围内。氟唑菌酰羟胺在四川、山东两地烟草上的消解趋势符合一级动力学方程，取样间隔5 d和35 d时烟草上氟唑菌酰羟胺的消解率分别超过50%和90%，理论半衰期在5.73～9.12 d之间。国内和CORESTA暂未制定氟唑菌酰羟胺在烟草上的MRL和检测方法标准，研究结果可为其限量标准、检测标准的制定提供数据和方法参考。

烟草；GC-MS/MS；氟唑菌酰羟胺；残留

新型吡啶酰胺类杀菌剂氟唑菌酰羟胺（pydiflumetofen）于2015年获得ISO农药通用名[1]，2020年1月在我国首获批准登记[2-3]。随着氟唑菌酰羟胺在世界范围内的推广使用，许多国家和团体先后制定了在多种作物上的最大残留限量标准[4]，但国内和国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）暂无氟唑菌酰羟胺的最大残留限量和检测方法标准可供参考[5-11]。

毕风兰等[12]、吴琴燕等[13]使用乙腈和水混合溶液提取，固相萃取净化或不净化，液相色谱或液相色谱-串联质谱测定了小麦麦穗中氟唑菌酰羟胺残留量；智沈伟等[14]、MUSARURWA等[15]、赵方方等[16]、孔顺等[17]、王富芸等[18]使用乙腈提取，分散固相萃取净化，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定了西瓜、番茄、香蕉等多种蔬菜、水果中氟唑菌酰羟胺残留量。所见报道使用的检测仪器多为液相色谱-串联质谱，未见使用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS），也未有烟草上氟唑菌酰羟胺检测方法相关报道。LC-MS/MS可检测的农药种类广泛，但仪器采购和运行费用较高，流动相配制较为繁琐，且较短的液相色谱柱难以有效分离相似化合物导致假阳性，影响结果准确性；与LC-MS/MS相比，GC-MS/MS对化合物具有更高的分离效果和选择性，且操作简便，更适合于烟草等复杂基质样本中农药的微量分析。

鉴于此，本研究基于GC-MS/MS建立了烟草上氟唑菌酰羟胺的残留检测方法，并研究了其在烟草上的消解动态，为烟草氟唑菌酰羟胺最大残留限量标准制定提供技术和数据参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

气相色谱仪（Agilent 7890 B，美国Agilent公司）；三重四级杆质谱仪（7000 C，美国Agilent公司）；涡旋混合振荡仪（UMV-2，北京优晟联合科技公司）；低速离心机（TDZ5-WS，长沙湘鑫仪器公司）；高速离心机（CF 16RN，日本HITACHI公司）；电子天平（ER-182A，感量0.000 1 g，日本A&D公司）；氮吹仪（NEVAP 24，美国Organomat公司）。

氟唑菌酰羟胺（Pydiflumetofen）和灭蚁灵（Mirex，内标）标准品溶液，100 µg/mL，农业农村部环境保护科研监测所；QuEChERS净化管（200 mg GCB, 400 mg PSA, 400 mg C18, 1200 mg无水MgSO4），美国Agilent公司；乙腈、丙酮、正己烷为色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试样前处理

试样提取：称取1 g（精确至0.000 1 g）烟草样本于50 mL旋塞离心管中，移取0.1 mL内标工作液和10 mL乙腈，2 000 r/min涡旋混合振荡10 min，在低速离心机上以4 000 r/min离心10 min，获得提取上清液。

试样净化：移取6 mL提取上清液转入QuEChERS净化管中，2 000 r/min涡旋混合振荡2 min，在高速离心机上10 000 r/min离心10 min，获得净化上清液。

溶剂置换：移取1 mL净化上清液于1.5 mL离心管中，以45 ℃氮吹至近干，加入1 mL丙酮/正己烷（体积比1∶1）复溶，经0.22 μm有机系滤膜过滤后转入进样瓶，制得进样溶液。

1.3 标准曲线制备

灭蚁灵内标工作液：移取0.1 mL标准品溶液用正己烷定容至10 mL，得浓度为1 µg/mL的灭蚁灵内标工作液，4 ℃条件下储存。

氟唑菌酰羟胺标准储备液：移取0.5 mL标准品溶液用丙酮定容至10 mL，得浓度为5 µg/mL的氟唑菌酰羟胺标准储备液，4 ℃条件下储存。

基质标准工作溶液：按照1.2的步骤制备烟草空白样本进样溶液（不加内标工作液）。分别移取1、0.4、0.2、0.1、0.02、0.002 mL氟唑菌酰羟胺标准储备液和0.1 mL内标工作液于10 mL容量瓶中，用烟草空白样本进样溶液定容至刻度，得氟唑菌酰羟胺浓度分别为0.5、0.2、0.1、0.05、0.01、0.001 µg/mL，内标浓度为0.1 µg/mL的基质标准工作溶液，现配现用。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 熔融毛细管气相色谱柱DB-5MS（15 m×0.25 mm× 0.25 μm）；进样口温度280 ℃，传输线温度280 ℃；柱温程序升温：初温60 ℃保持2 min，先以30 ℃/min升温至150 ℃，再以3 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min；载气He；不分流进样，进样量1 μL。

1.4.2 质谱条件 电子轰击离子源（EI），电离能量70 eV；离子源温度280 ℃，四级杆温度180 ℃；溶剂延迟5 min；淬灭气：He，2.25 mL/min；碰撞气：N2，2.25 mL/min；扫描方式：多反应监测（MRM），监测参数见表1。

表1 质谱多反应监测参数

1.5 方法可靠性评价

参考《农作物中农药残留试验准则》[19]中相关要求，农药残留检测方法可靠性包括灵敏度、精密度和准确度，灵敏度以检测限（LOD）和定量限（LOQ）表示，精密度以多次进样（≥6）响应峰面积之间的相对标准偏差（RSD）表示。准确度以添加回收率表示，设置3个添加水平，分别为定量限、10倍定量限和标准曲线最大浓度，每个水平设5次重复。

1.6 田间试验设计

参考《农作物中农药残留试验准则》[19]，于2022年分别在四川泸州、山东莒县开展消解动态试验，氟唑菌酰羟胺有效成分用量67.5 g/hm2，设施药1次、2次和3次3个处理，每个处理重复3次，施药间隔期7 d。采样距最后一次施药的时间间隔分别为2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d。每次随机采集小区内正常生长的烟叶30片，去掉主脉后55 ℃烘干，粉碎过40目筛后四分法留样100 g左右，置于−20 ℃保存[20]。

1.7 消解方程

烟草中农药消解动态一级动力学方程：

式中：为降解速率常数；

C为农药初始残留量（mg/kg）；

C为时刻农药残留量（mg/kg）。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

使用MS1 Scan方法对氟唑菌酰羟胺标准品溶液进行全扫描，如图1所示，从MS1质谱图中得到质荷比（/）丰度相对较高的4个前级离子159、193、195和232。使用产物离子扫描方法分别获得4个前级离子的二级质谱产物离子，其中前级离子232的产物离子159和前级离子159的产物离子139、57丰度相对较高干扰较小；前级离子193、195的产物离子中丰度较高的有123、157和159，但其丰度不及232和159的产物离子且干扰较大。多反应监测（MRM）模式下随着碰撞能量（CE）增大，前级离子会碎裂产生更多的产物离子，同时，具有碎裂能力的产物离子会随着碰撞能量的增大继续碎裂成质量数更小的产物离子，适宜的碰撞能力可提高产物离子丰度。从5 eV至50 eV每隔5 eV设定一个碰撞能量进行梯度进样，如图2、图3所示，碰撞能量为10 eV时，前级离子232的产物离子159的丰度高且无干扰，为定量离子对，碰撞能量分别为20 eV和25 eV时，前级离子159的产物离子139和57丰度高干扰较小，为定性离子对。

图1 氟唑菌酰羟胺前级离子TIC图

2.2 方法的线性相关性与精密度

按照1.3配制基质标准工作溶液，按照1.4设置仪器条件，采集相应的质谱图。以氟唑菌酰羟胺质量浓度为横坐标，质谱相应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，如图4所示，氟唑菌酰羟胺在0.001 mg/L ～0.5 mg/L质量浓度范围内2=0.999 5。取0.1 mg/L基质标准工作溶液重复6次进样，平均峰面积56701，相对标准偏差RSD=4.57%。毕风兰等[12]、吴琴燕等[13]在测定小麦上氟唑菌酰羟胺时标准曲线的决定系数分别为0.998 8、0.983 2，烟草与小麦同属干物质类样本，与报道相比，本方法具有更高的线性相关性，且精密度良好。

图4 氟唑菌酰羟胺标准曲线

2.3 仪器检测限与方法定量限

参考GB/T 5009.1—2003[21]，如表2所示，以仪器3倍噪音与标准曲线回归方程中斜率的比值获得仪器检测限为0.35 µg/L，进样溶液中被测组分定量限为1.2 µg/L，烟草样本中被测组分定量限为0.012 mg/kg。智沈伟等[14]、赵方方等[16]、王富芸等[18]、刘士领[22]建立的LC-MS/MS方法中，氟唑菌酰羟胺在西瓜、香蕉、番茄和苹果等蔬菜、水果上的定量限均为0.01 mg/kg，与本方法相当。但在实际测定时，烟草样本中被测组分的定量限受样本称取质量、提取液体积、分取体积和浓缩体积等多种因素的共同影响，在本方法中加大样本量、减少提取液体积，以及提高浓缩倍数，均可降低被测组分的定量限。

表2 氟唑菌酰羟胺检出限与定量限

2.4 方法的准确度

准确度是多次测定平均值与真值相符合的程度，用以表示误差的大小。在空白样本中添加0.012、0.12和0.5 mg/kg这3个水平的氟唑菌酰羟胺标准样品，按1.3、1.6所述进行样本前处理和检测，结果如表3所示，3添加水平的平均回收率分别为101.7%、93.6%、92.6%，测定平均值与理论添加值（真值）之间的相对标准偏差RSD分别为4.5%、3.1%和2.6%。吴琴燕等[13]测定小麦上氟唑菌酰羟胺的回收率为80.3%～115.8%，RSD为2.4%～10.5%；Rong等[23]测定谷物和小麦上氟唑菌酰羟胺的回收率为75.1%～110.3%，RSD为2.8%～13.7%，表明本方法具有更高的准确度。

表3 烟草中氟唑菌酰羟胺的添加回收率结果

2.5 消解动态试验结果

如表4所示，在四川和山东，3个施药处理的烟叶上氟唑菌酰羟胺原始沉积量分别为29.33、22.34、32.87 mg/kg和13.77、14.77、18.98 mg/kg。烟叶上氟唑菌酰羟胺的消解率，取样间隔5 d时为50.7%～80.7%，消解率均超过50%，取样间隔35 d时为92.6%～98.9%，消解率均超过90%，消解速率较快，且显示出在四川试验点的消解速率大于在山东试验点消解速率的趋势。

以取样时间及对应的氟唑菌酰羟胺残留量进行指数回归分析，如表5所示，氟唑菌酰羟胺在四川和山东烟叶上的消解动态均符合一级动力学方程，理论半衰期5.73～9.12 d；其中在四川试验点的理论半衰期平均为6.78 d，在山东试验点的理论半衰期平均为8.52 d，与两个试验点氟唑菌酰羟胺消解速率结果的差异性一致。

表4 氟唑菌酰羟胺在烟草上的消解动态

表5 氟唑菌酰羟胺在烟草上的消解参数

3 结 论

建立了基于GC-MS/MS多反应监测模式测定烟草上氟唑菌酰羟胺残留量的检测方法，并使用该方法分析了四川、山东烟草试验样本上氟唑菌酰羟胺的消解动态。优化后的质谱参数可有效降低杂质等非目标物离子的干扰，线性相关性良好，精密度、定量限和准确度等符合农作物中农药残留试验准则对检测方法的要求。对180份试验样品进行测定，氟唑菌酰羟胺在烟草上的消解动态符合一级动力学方程。该方法能够满足批量烟草样本中氟唑菌酰羟胺的微量分析。

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Determination of residues of 448 pesticides and related chemicals in tea by liquid chromatography-mass spectrometry: GB 23200.13—2016[S]. Beijing: China Agriculture Press, 2016.

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GC-MS/MS Determination of Pydiflumetofen Residues in Tobacco

PAN Miao1, 2, YU Weisong1, LU Shijun1, CAO Jianmin1, SUN Huiqing1*

(1. Institute of Tobacco Research of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

In order to fill the gap in the field, a gas chromatography-tandem mass spectrometry multi-reaction monitoring mode (MRM) was established for the determination of pydiflumetofen residue in tobacco, and the digestion resolution dynamics of pydiflumetofen in tobacco were analyzed through field experiments. The results show that the method has good linearity in the mass concentration range of 0.001～0.5 mg/L, and the correlation coefficient2=0.999 5; RSD was 4.57% when repeated determination of the same test sample, and the limit of quantification was 0.012 mg/kg. At 0.012, 0.12 and 0.5 mg/kg supplemental levels, the average recovery rate ranged from 92.6% to 101.7%, and RSD ranged from 2.6% to 4.5%. The digestion trend of pydiflumetofen in tobacco in Sichuan and Shandong was in line with the first-order kinetic equation. The digestion rate of pydiflumetofen in tobacco was more than 50% and 90% at sampling interval of 5 d and 35 d, the theoretical half-life of pydiflumetofen in tobacco was between 5.73 d and 9.12 d. MRL is not established in China or by CORESTA for detection method standards for pydiflumetofen in tobacco, and the research results can provide data and method reference for the formulation of limit standards and detection standards.

tobacco; GC-MS/MS; pydiflumetofen;residues

S435.72

A

1007-5119(2023)06-0053-06

中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC06）

潘 苗（1998-），女，硕士研究生，研究方向为农药残留与质量安全研究。E-mail：1911465244@qq.com*通信作者，E-mail：sunhuiqing@caas.cn

2023-06-21

2023-09-12

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.008