γ-干扰素诱导蛋白-10 mRNA检测试验对不同年龄人群结核病的辅助诊断价值

宋瑞雪 董静 姚明旭 贾红彦 李自慧 孙琦 朱传智 杜博平 邢爱英 潘丽萍

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的严重威胁人类健康的传染性疾病,其防控形势依然严峻[1]。对结核病防控的关键在于尽早诊断和及时治疗。尽管分子生物学技术的发展使得目前病原学检出率有所提升,但临床仍存在约50%的病原学阴性结核病患者,需要依靠免疫学、影像学等辅助方法进行诊断[2]。

近年来,有研究发现γ-干扰素诱导蛋白-10(interferon gamma-induced protein 10,IP-10)可能作为结核病辅助诊断的新靶标[3-4]。IP-10是CXC家族中的一种趋化因子,在结核特异性抗原刺激后其表达水平明显高于γ-干扰素(IFN-γ)[5]。有研究发现,在结核抗原刺激的2.5～8 h内,IP-10 mRNA的表达可以上调约100倍[6],故以IP-10 mRNA为靶点诊断结核感染可能带来更高敏感性[7-8]。既往研究发现,IP-10 mRNA可用于结核感染的检测[9],而且对结核病具有一定的辅助诊断价值,但目前尚无在不同年龄组中分析IP-10 mRNA检测诊断性能的数据。因此,本研究采用前瞻性分析,纳入了1590例疑似结核病患者,根据年龄分为中青年组和老年组,根据最终临床诊断结果,分别对不同年龄组内IP-10 mRNA检测结果进行比较分析,进一步评估IP-10 mRNA检测技术对不同年龄组结核病的辅助诊断价值。

对象和方法

一、研究对象

于2018年3月至2022年7月,在首都医科大学附属北京胸科医院、河南省传染病医院和深圳市第三人民医院连续性、前瞻性纳入疑似结核病患者,共计1590例,剔除诊断不明确200例,共1390例纳入分析。根据研究对象的临床表现、常规生化检测、结核病病原学检测、影像学检测和(或)病理学检测结果,将上述患者分为确诊结核病组475例、临床诊断结核病组518例和非结核病组397例。本研究通过首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准,编号为(2018)年临审第(2017-40-01)和(2019)年临审第(2017-40-02),所有研究对象入组前均签署知情同意书。

二、纳入和排除标准

1. 纳入标准:(1)确诊结核病组:参照《WS 288—2017 肺结核诊断》[10],具有结核病临床表现且具有MTB病原学诊断依据者。(2)临床诊断结核病组:参照《WS 288—2017 肺结核诊断》[10],具有结核病临床表现且具备结核病影像学表现,排除肺部其他疾病者。(3)非结核病组:主要指肺炎、肺癌、非结核分枝杆菌病等易混淆疾病,均按相应疾病的诊断标准进行诊断,并经临床诊断及鉴别诊断最终确诊。

2.排除标准:年龄<18岁,最终诊断不明或者随访期内诊断更改。

三、研究方法

1.IP-10 mRNA检测:采用IP-10 mRNA检测试剂盒(苏州创澜生物科技有限公司)并严格按照试剂盒说明书进行。采集肝素抗凝静脉血均匀分至空白对照管(N管)、结核抗原管(T管)和阳性抗原管(P管),每管1.2 ml,立即轻柔颠倒混匀3～5次,使血液充分与管内壁接触,然后转入37 ℃恒温培养箱内孵育培养6 h。孵育后的全血标本在全自动核酸检测反应体系构建系统上完成外周血标本的RNA提取(仪器全自动操作,苏州创澜生物科技有限公司,Innovo-100)。取10 μl RNA,按照50 ℃ 20 min,85 ℃ 2 min逆转录成cDNA。取10 μl cDNA,15 μl聚合酶链式反应缓冲液(包含探针、酶和缓冲液),组成25 μl扩增体系,按照50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s循环40次,完成实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR), qPCR检测在美国ABI公司7500实时荧光定量PCR仪上完成。软件自动计算靶标IP-10和内参基因CHMP2A的扩增循环阈值(cycle threshold,Ct),采用ΔCt=Ct靶标基因-Ct内参基因的方法分别计算N管、T管和P管中靶标IP-10 mRNA的相对表达量。

2.结果判读标准:当T管中IP-10 mRNA的相对表达量减去N管中IP-10 mRNA的相对表达量≤-1.04,定义为阳性结果;当T管中IP-10 mRNA的相对表达量减去N管中IP-10 mRNA的相对表达量>-1.04,且P管中IP-10 mRNA的相对表达量减去N管中IP-10 mRNA的相对表达量≤-1.2时,定义为阴性;当T管中IP-10 mRNA的相对表达量减去N管中IP-10 mRNA的相对表达量>-1.04,且P管中IP-10 mRNA的相对表达量减去N管中IP-10 mRNA的相对表达量>-1.2时,定义为不确定结果。

四、 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行数据的统计学分析。偏态分布的计量资料以“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”描述,组间差异的比较采用Mann-WhitneyU检验;计数资料以“百分率/构成比(%)”描述,组间差异的比较采用χ2检验。基于R语言完成敏感度和特异度变化的Mann-Kendall趋势检验,散点图应用Prism 8.0绘制。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般特征

1390例纳入分析的研究对象中,确诊结核病组475例,包括男317例,女158例,年龄18～88岁,中位年龄为41岁;临床诊断结核病组518例,其中男300例,女218例,年龄18～95岁,中位年龄为37岁;非结核病组397例,其中男232例,女165例,年龄18～88岁,中位年龄为53岁。具体见表1。

表1 研究对象的一般特征

按照世界卫生组织年龄分段将纳入分析的人群进行分组[11],中青年组1062例(18～59岁)和老年组328例(60～95岁)。中青年组中,结核病患者810例,男489例,女321例,中位年龄33岁,其中确诊结核病患者376例,男243例,女133例,中位年龄33岁;临床诊断结核病患者434例,男246例,女188例,中位年龄33岁;非结核病患者252例,男146例,女106例,中位年龄45岁。老年组中,结核病患者183例,男128例,女55例,中位年龄66岁。其中确诊结核病患者99例,男74例,女25例,中位年龄66岁;临床诊断结核病患者84例,男54例,女30例,中位年龄67岁;非结核病患者145例,男86例,女59例,中位年龄67岁。

二、IP-10 mRNA检测的诊断效能评估

1.IP-10 mRNA检测在结核病辅助诊断中的价值评估:1390例纳入分析的研究对象中,IP-10 mRNA检测有效者1366例(98.3%),不确定结果24例(1.7%),其中,结核病组13例,非结核病组11例,主要原因是阳性对照管中靶标IP-10的相对表达量低于设定的阈值。剔除获得的24例不确定结果,在剩余的1366例有效检测标本中分析IP-10 mRNA检测的诊断效能。结核病组980例患者中,880例IP-10 mRNA检测阳性;非结核病组386例患者中,246例IP-10 mRNA检测阴性。以临床诊断为标准,IP-10 mRNA检测的敏感度为89.8%(95%CI:87.7%～91.6%),特异度为63.7%(95%CI:58.7%～68.5%)。IP-10 mRNA检测的阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别为86.3%(95%CI:84.0%～88.3%)、71.1%(95%CI:66.0%～75.8%)、2.48(95%CI:2.17～2.83)、0.16(95%CI:0.13～0.19)。其中确诊结核病组和临床诊断结核病组的阳性检出率分别为92.3%(432/468,95%CI: 89.4%～94.4%)和87.5%(448/512,95%CI: 84.2%～90.2%)。在非结核病组中,肺癌组、肺炎组和非结核分枝杆菌病组的阴性检出率分别为53.7%(72/134,95%CI:44.9%～62.3%)、61.3%(106/173,95%CI:53.6%～68.5%)和83.3%(35/42,95%CI:68.0%～92.5%)。

2.不同年龄组中IP-10 mRNA检测辅助诊断结核病的性能分析:中青年组(18～59岁)中,结核病组患者799例,非结核病组患者247例,IP-10 mRNA检测的敏感度和特异度分别为90.2%(95%CI:87.9%～92.1%)和68.8%(95%CI:62.6%～74.4%)。中青年组中,按照0～20岁、20～40岁、40～60岁进行了进一步亚组分析。在0～20岁中,31例结核病组患者中27例IP-10 mRNA检测阳性,5例非结核病组患者中3例IP-10 mRNA检测阴性,IP-10 mRNA检测的敏感度和特异度分别为87.1%(95%CI:69.2%～95.8%)和60.0%(95%CI:17.0%～92.7%);20～40岁中,480例结核病组患者中435例IP-10 mRNA检测阳性,86例非结核病组患者70例IP-10 mRNA检测阴性,IP-10 mRNA检测的敏感度和特异度分别为90.6%(95%CI:87.6%～93.0%)和81.4%(95%CI:71.2%～88.7%);在40～60岁中,288例结核病组患者中259例IP-10 mRNA检测阳性,156例非结核病组患者中97例IP-10 mRNA检测阴性,IP-10 mRNA检测的敏感度和特异度分别为89.9%(95%CI:85.7%～93.0%)和62.2%(95%CI:54.0%～69.7%)。老年组(60～95岁)中,结核病组患者181例,非结核病组患者139例,IP-10 mRNA检测的敏感度和特异度分别为87.8%(95%CI:82.0%～92.0%)和54.7%(95%CI:46.0%～63.1%)。IP-10 mRNA检测的敏感度在中青年组和老年组间差异无统计学意义(χ2=0.922,P=0.337),中青年组IP-10 mRNA检测的特异度高于老年组,差异有统计学意义(χ2=7.704,P=0.006)。具体见表2。

表2 不同年龄组中IP-10 mRNA检测结核病的效能分析

3.IP-10 mRNA检测的敏感度和特异度随年龄变化趋势:以每10岁为一个年龄组,将结核病组980例及非结核病组386例患者进行分组。随着年龄增加,IP-10 mRNA检测的敏感度变化趋势见图1。结果显示,无论是确诊结核病组(Z=-0.157,P=0.875)、临床诊断结核病组(Z=-0.601,P=0.548)或所有结核病组(Z=-1.063,P=0.288)中,IP-10 mRNA检测的敏感度随年龄变化差异均无统计学意义。各年龄组内IP-10 mRNA诊断特异度变化趋势见图2。结果显示,IP-10 mRNA检测的特异度在30岁及以下人群中达到顶峰(81.8%),随后随年龄增长诊断特异度逐渐降低(Z=-2.846,P=0.004)。

图1 IP-10 mRNA检测结核病敏感度随年龄变化折线图

图2 IP-10 mRNA检测结核病特异度随年龄变化折线图

讨 论

目前,关于IP-10用于结核病诊断的荟萃分析研究提示其检测的综合敏感度为85%(95%CI:80%～88%),综合特异度为89%(95%CI:84%～92%)[12],提示IP-10作为结核病辅助诊断靶标的可行性。IP-10 mRNA检测作为一种新的结核感染诊断靶标,在既往研究中对其辅助诊断结核病的性能有所分析,提示在诊断结核病中也有着良好的性能[13],但其在不同年龄分组中,特别是老年群体中对结核病辅助诊断的性能如何,现阶段数据不足。本研究募集了一组较大样本量的疑似结核病患者队列,根据最终诊断分为结核病组和非结核病组,并在中青年组和老年组中分别探讨了以IP-10 mRNA为靶标的检测技术的诊断效能,发现在中青年和老年组结核病患者中IP-10 mRNA检测的敏感度差异并无统计学意义,而且在年龄分层分析中IP-10 mRNA检测的敏感度差异也无统计学意义,提示IP-10 mRNA检测的敏感度受年龄影响较小。既往关于γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assays,IGRA)的诊断性能评价中,均提示IGRA检测结核病的敏感度随年龄增长而下降[14-16],国内研究结果也提示IGRA检测对老年结核病的敏感度相较于中青年组明显降低[17-18],提示老年人中应用IGRA检测会存在更高比例的假阴性结果。但本研究发现IP-10 mRNA检测对老年结核病的敏感度不受年龄影响,因此,相对于传统的IGRA检测,在老年疑似结核病患者中应用IP-10 mRNA检测技术进行结核病诊断,可能获益更多。

本研究中IP-10 mRNA检测对疑似结核病的敏感度和特异度分别为89.8%(95%CI: 87.7%～91.6%)和63.7%(95%CI:58.7%～68.5%),其敏感度与文献报道结果相似,但特异度相对较低[19]。IP-10 mRNA检测作为结核感染的诊断方法,与IGRA类似,并不能区分结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核病。年龄增长、免疫力低下是结核感染的危险因素[20-21],本研究中非结核病组患者多为老年肺癌和肺炎患者,免疫力低且容易合并感染(中位年龄为53岁),导致结核分枝杆菌潜伏感染比例增加,进而表现为IP-10 mRNA检测特异度较低。而既往关于IP-10蛋白用于诊断结核病的Meta分析中[4],主要以健康人、儿童非结核病患者或密切接触者作为对照组,相较于本研究的对照组其潜伏感染风险相对较低,特异度较高。本研究也在不同年龄组中分析了其特异度,发现在40岁及以下群体中,IP-10 mRNA检测的整体特异度维持在80%以上。尽管在低于20岁的群体中,特异度仅为60%,但这很大程度上是因为本研究中低于20岁的非结核病组患者例数太少(5例)导致。随着年龄增长,在40岁及以上年龄的人群中,潜伏感染风险增高,导致特异度逐渐降低,在老年组中降至60%以下。这一数据与国内既往关于老年人中IGRA检测的结果一致,即在我国超过60岁的老年人群中,潜伏感染率明显上升,超过30%[22-23]。

老年患者由于缺乏典型临床症状、病原学检出率低及因免疫反应受损导致对IGRA等诊断反应减弱,因此结核病诊断困难。但与青年人相比,老年人患结核病的风险却增加了1.5倍[24],说明对老年疑似结核病患者的临床诊断需求更加强烈。同时,在《老年肺结核诊断与治疗专家共识(2023版)》[25]中也指出对于具有危险因素的老年结核分枝杆菌潜伏感染者,建议进行相关的结核病筛查。有研究表明,体外应用MTB抗原刺激外周血单个核细胞产生的IFN-γ比年轻人低,且在动物实验中老年小鼠对MTB的易感性增加,这可能与CD4+T细胞介导的免疫受损有关[26],这也是IGRA检测敏感度随年龄增加而降低的原因之一。但本研究结果提示IP-10 mRNA检测敏感度不受年龄影响,提示IP-10的释放存在其他细胞来源或存在其他通路调节机制,仍需要进一步探究。

综上,本研究基于临床真实世界的研究队列,评估了IP-10 mRNA检测在不同年龄组中对结核病诊断的性能,特别是分析了其在临床鉴别诊断困难的老年疑似结核病患者中的诊断性能,结果提示,IP-10 mRNA检测在老年结核病诊断中只能作为辅助手段;但在缺乏病原学证据的情况下,由于IP-10 mRNA检测的敏感度不受年龄增长影响,因此,其阴性结果能够更好地提示临床医生优先考虑其他非结核性疾病。

本研究尚存在一些不足之处。首先,在研究评估IP-10 mRNA检测的效能时,并未同时纳入IGRA检测进行对比分析。其次,受样本量限制,本研究并未进一步对IP-10 mRNA检测在其他合并症人群中的诊断效能进行评估,其中包含糖尿病、其他免疫疾病人群和HIV感染人群等,未来应在各类特殊人群中进行深入分析,以便于指导临床应用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献宋瑞雪:实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章;董静和姚明旭:实施研究、采集数据;贾红彦:对文章的知识性内容作批评性审阅;李自慧:获取研究经费、支持性贡献;孙琦、杜博平和邢爱英:行政/技术/材料支持、支持性贡献;朱传智:获取研究经费;潘丽萍:酝酿和设计实验、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、指导、支持性贡献