国宇晴, 李晗熙, 白鈴泓, 姜 雯, 廉美兰, 朴炫春
(延边大学 农学院,吉林 延吉 133002)
何首乌(PolygonummultiforumThunb.)属于蓼科蓼属的植物,又名赤首乌、小独根等,主要分布在黄河以南,以广东、贵州、四川、湖北等地[1]。何首乌的主要化学成分包括黄酮类、酚类、二苯乙烯苷类、蒽醌类以及磷脂类等[2-4],这些化学成分与抗氧化、抗癌、抗炎等生物活性具有极大相关性[5-9]。有研究表明,黄酮类化合物具有抗氧化活性[10-11]。随着何首乌需求量的增加,何首乌乱采滥挖的现象日益严重,以传统的种子、块根、扦插繁殖等方式为主,组织培养方式为辅,但仍存在市场供应与需求量不对等的问题[12]。根据何首乌离体培养的生长特性,以何首乌不定根进行悬浮培养以期高产[13]。生物反应器是一种快速扩繁的手段[14],因此,采用生物反应器作为快速获得何首乌不定根材料的途径,以解决何首乌资源紧缺等问题。
天然产物活性成分的提取是开发天然产物的关键一步[15],传统提取工艺包括超声辅助提取法、水加热提取、超声波-微波协同提取法、热水回流法等[16-20],随着提取技术具有突破性进展,闪式提取方法逐渐被关注。闪式提取法是一种将植物组织破碎的新型提取技术,依靠高速机械剪切力和超动分子渗透技术,在室温及溶剂存在下经数秒把植物的各组织破碎以快速提取植物材料中活性物质的方法[21-22]。已有研究发现,何首乌提取过程中存在诸多问题,例如传统提取方法中耗时过长[23]、有机溶剂使用量高[24]等,因此,该试验采用闪式提取法对反应器培养的何首乌不定根进行提取。为对闪式提取工艺进行优化,已有研究表明,响应面法与正交法存在区别,正交法并不能对各个因素逐一诠释并且不能对各因素间交互作用进行分析,故无法建立函数模型,因此无法明确最优方案,而响应面可用于评估各种试验过程中的多个参数以及各个变量之间的交互作用,可经建立函数关系确定最优组合[25-30],故通过响应面法对闪式提取工艺进行优化。
该试验以生物反应器培养的何首乌不定根为植物材料,利用闪式提取法对不定根中总黄酮进行提取,以不定根提取物的总黄酮含量为指标通过响应面法进行优化,并利用体外抗氧化方法对何首乌不定根抗氧化活性做出评价,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力评价其抗氧化活性,为进一步开发何首乌不定根资源提供理论依据。
将10 g新鲜的何首乌不定根接种于3 L反应器内(含有2 L培养液),培养基为MS+2 mg/L IBA+50 g/L蔗糖,pH值调节为5.8,通气量为0.1 vvm,25 ℃条件下暗培养60 d,收获后将不定根用自来水清洗,置于45 ℃恒温干燥箱中烘干48 h,即得何首乌不定根干品。
试验用闪式提取仪(上海钒帜精密设备有限公司)提取。将3 g不定根干品以及提取溶剂放置于容器内,提取时闪式提取仪电压为220 V,转数5 000 r/min,通过对提取溶剂、闪式提取时间、提取溶剂浓度以及液料比的调控,优化提取工艺。经闪式提取仪提取后过300目筛,收集滤液,45 ℃烘干箱中烘干至恒重,称重并计算提取率,利用硝酸铝比色法测定提取物的黄酮含量,最后计算黄酮得率,以此作为确定提取条件的指标。
黄酮得率/%=黄酮含量/(mg·g-1)×提取率/%×0.001.
1.2.1 单因素试验
1) 提取溶剂的筛选:提取溶剂为80%甲醇、80%乙醇及蒸馏水,液料比为40∶ 1 (mL∶g),提取时间50 s。
2) 溶剂浓度的筛选:将提取溶剂(乙醇)浓度设置为20%,40%,60%,80%和100%,液料比为40∶1 (mL∶g),提取时间为50 s。
3) 提取液料比的筛选:将液料比分别设置为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL∶g),提取时间为50 s,依据上述试验结果使用60%的乙醇作为提取溶剂浓度。
4) 提取时间的筛选:将提取时间设置为30、40、50、60、70 s,依据上述试验结果使用60%的乙醇作为提取溶剂浓度,液料比为50∶1 (mL∶g)。
1.2.2 响应面试验设计
在单因素试验的基础上,以提取时间(A),溶剂浓度(B),液料比(C) 3个因素为自变量,以提取物中黄酮得率为响应值,依据Box-Behnken法进行3因素3水平试验设计(表1),共计15个组合[31]。按照各组合条件进行闪式提取,后对给予的优化组合进行3次重复的验证试验,确定最佳提取工艺。
表1 响应面试验因素及水平
1.2.3 总黄酮的测定
根据张超等[32]测量总黄酮方法,应用硝酸铝比色法测定总黄酮含量,以芦丁为标准品。称取芦丁标准品10 mg置于容器内,加入70%乙醇溶解,并定容至250 mL。分别吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL的芦丁溶液于试管内,用70%乙醇定容至2 mL。依次向试管中加入0.3 mL的5%NaNO2,静置6 min后;再加入0.3 mL 10%Al(OH)3溶液,静置6 min。最后,加入2.0 mL 4%NaOH溶液。于510 nm处测定OD值,绘制标准曲线。
称取0.01 g不定根提取物,用70%乙醇溶解并定容至25 mL后,取0.2 mL至试管中并定容至2 mL,按标准品操作流程,分别加入等量的3种溶液,于510 nm处测定液体OD值。
总黄酮含量/(mg·g-1)=CVD/m,
式中,C为提取物溶液中总黄酮浓度/(mg·mL-1),V为样品溶液体积/mL,D为液体稀释倍数,m为提取物样品质量/g。
1.3.1 DPPH自由基清除能力测定
根据参考文献[33]的方法并稍作修改。将待测样品溶解于去离子水中通过二倍稀释法稀释为不同浓度的待测样液,吸取100 μL待测样液,加入至100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液于96孔板中并混匀,室温避光静置30 min后,在波长517 nm处测定吸光度。用去离子水代替样液作为空白,用VC代替样液作为阳性对照,每个浓度平行测定3次后取平均值,根据下式计算样品对DPPH自由基的清除率,并根据不同浓度提取物的清除能力计算得到半数抑制浓度(EC50)。
DPPH自由基清除率/%=A0/A1×100%,
式中,A0为空白吸光度;A1为样品以及VC与DPPH溶液反应后的吸光度。
1.3.2 ABTS自由基清除能力的测定
参考Hui[34]的方法并稍作修改。将2.45 mmol/L过硫酸钾与7.0 mmol/L ABTS溶液按体积比1︰1混合均匀后,室温避光过夜放置12~16 h,使用前用无水乙醇稀释至波长734 nm处吸光度为0.7±0.02,即为ABTS工作液。将待测样品溶解并稀释成不同浓度的待测样液, 吸取50 μL待测样液与150 μL ABTS于96孔板内混匀,在黑暗条件下反应30 min,在波长734 nm处测定其吸光度。用甲醇代替样液作为空白,用VC代替样液作为阳性对照,每个浓度平行测定3次后取平均值,根据下式计算样品对ABTS自由基清除率,得到半数抑制浓度(EC50)。
ABTS自由基清除率/%=(A0-A1)/A0×100,
式中,A0为空白吸光度;A1为样品以及VC与ABTS工作液反应后的吸光度。
所有试验重复3次,利用SPSS 25.0软件程序对单因素试验中显著性差异进行分析,Design Expert 10.0进行响应面分析,GraphPad Prism 8.0软件绘制单因素试验以及DPPH自由基、ABTS自由基清除试验图,显著水平P<0.05。
2.1.1 闪式提取溶剂对何首乌不定根总黄酮含量的影响
该研究通过闪式提取法进行提取,首先对提取溶剂进行优化。
由图1可知,当溶剂为乙醇时,何首乌不定根总黄酮得率达到最高,并显著高于甲醇与水溶剂的黄酮得率,选择有机溶剂作为提取溶剂,导致黄酮得率较高的原因可能是杂质较少[35],因此,该试验选择乙醇作为提取溶剂进行下一步试验。
注:数值为平均值±标准偏差(n=3)。
2.1.2 不同提取条件对何首乌不定根总黄酮含量的影响
经上述试验选择乙醇为提取溶剂后,对乙醇浓度进行筛选。分别设置乙醇浓度为20%、40%、60%、80%和100%等5个处理,由图2-A可知,总黄酮得率随着乙醇浓度的升高呈先增长后下降的趋势,当乙醇浓度为60%时,黄酮得率达到最高,为15.5 %,当乙醇浓度为80%以及100%时,何首乌不定根黄酮得率反而降低,这可能与黄酮的组成有关系,由此可以推测,何首乌不定根中的黄酮类物质具有极性[36],因此,确定60%乙醇为最佳处理。
图2 不同提取条件对黄酮得率的影响
确定使用60%乙醇为溶剂进行提取后,对液料比条件进行筛选。液料比为60%溶剂用量(mL)与不定根干品(g)的比值,试验将设置以下5个处理:20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 (mL∶g)。如图2-B所示,黄酮得率随料液比增长而增长,在50∶1 (mL∶g)时达到最高,为22.88%,随后在液料比达到60∶1 (mL∶g)时,黄酮得率下降且达到最低,这可能是因为更多的溶剂会降低溶解在溶剂中的活性物质的传质阻力[37]。因此,选择液料比为50∶1 (mL∶g)进行下一步试验。
经上述试验发现,应通过60%乙醇且液料比为50∶1 (mL∶g)进行提取,为了探明时间对闪式提取何首乌不定根黄酮得率的影响,设置提取时间分别为:30、40、50、60和70 s。通过图2-C可以看出,黄酮得率随时间的增加而升高,在50 s后趋于稳定,且与60和70 s差异不显著,可能因为在达到最优处理时间后会存在颗粒过细等问题导致时间过长而黄酮得率降低[38],并且由于50 s更为节省时间,因此,选择50 s为最佳条件,进行下一步响应面优化。
根据单因素试验结果,择出60%乙醇为提取溶剂,闪式提取时间50 s,液料比50∶1 (mL∶g)。
将上述单因素试验作为基础,通过响应面分析法的Box-Behnken Design方法,进行3因素3水平的试验设计(表2),以溶剂浓度、提取时间及液料比为自变量,黄酮得率为响应值,结果表明存在差异,经多元拟合回归分析,得到二次回归模型方程:
表2 响应面试验结果
Y=24.62+1.56A+1.71B+1.24C+0.86AB-0.02AC+0.02BC-4.69A2-3.66B2-3.44C2,
式中,A、B及C分别为提取时间、溶剂浓度及液料比,Y为何首乌不定根黄酮得率的预测值。
图3 两因素交互作用对黄酮得率的影响
表3 方差分析结果
通过响应面分析法,对试验数据绘制多元二次回归方程,即得最优条件参数[39]。该试验通过对何首乌不定根闪式提取进行3因素3水平的响应面分析,结果表明回归模型充分拟合试验数据,故应用此模型分析结果以优化何首乌不定根闪式提取工艺。回归模型求解后最优提取工艺各参数分别为:提取时间51.9 s、溶剂浓度65.1%、液料比51.8∶1(mL∶g),此时响应值(黄酮得率)的预测值为25.1 %。
为验证试验结果的可靠度,该试验进行3次平行试验对求解结果进行验证。由表4可知,3次重复试验的黄酮得率为28.74%、29.83%和31.91%,相对标准偏差为0.66 %,表明3次重复试验结果稳定,与预测值吻合。
表4 验证试验结果
2.4.1 对DPPH自由基清除能力
为了评价何首乌不定根抗氧化活性,通过对DPPH清除能力判断其抗氧化活性,当抗氧化剂与呈紫色DPPH自由基结合时,溶液由深紫色变为淡黄色,说明具备抗氧化能力[40]。由图4可知,何首乌不定根粗提物(PMCE)对DPPH自由基清除能力随提取物浓度增大而提高,且达到最高后趋于平稳。通过计算可知,PMCE的EC50为25.9 μg/mL,VC的EC50则为10.8 μg/mL,与VC相差较小。
图4 粗提物对DPPH自由基清除能力
图5 粗提物对ABTS自由基清除能力
2.4.2 对ABTS自由基清除能力
ABTS自由基清除试验作为供氢抗氧化剂或断链抗氧化剂用于测定抗氧化活性[41]。由图7可知,PMCE对ABTS自由基的清除能力随浓度增加而增强,当浓度为2 mg/mL时,清除率最高,为99%,由此计算得出PMCE的EC50为148.5 μg/mL,具有良好的清除能力。
在闪式提取过程中被类似于提取溶剂、提取时间等因素影响提取结果,且需要考虑两种因素间的交互作用,因此采用Box-Behnken响应面法对闪式提取工艺进行优化[42-44]。徐亚男等[45]以多糖得率为指标,通过响应面法对闪式提取狼毒大戟愈伤组进行工艺优化,结果表明,液料比为39.967∶1 (mL∶g),提取时间为50.128 s,提取水温为52.034 ℃。张锋等[46]研究发现,响应面优化闪式提取无花果叶总黄酮工艺最优方案结果为:提取时间87 s,乙醇体积分数67%,液料比87∶1 (mL∶g)。李学峰等[47]通过调控闪式提取的几种因素对贯叶连翘不定根黄酮提取工艺进行了优化,经响应面法分析后得出结论:77.46%甲醇在液料比52.13∶1 (mL∶g),提取65.44 s时,黄酮得率最高。基于上述试验结论说明响应面法优化闪式提取工艺具有可行性。
周新新等[48]对枳实总黄酮进行提取工艺优化,发现闪式提取法以50%乙醇为溶剂为最优溶剂。赵成萍等[49]经响应面法优化闪式提取山楂果肉总黄酮工艺发现,最佳条件为66%乙醇,液料比44∶1 (mL∶g)、提取时间74 s,其提取溶剂与溶剂浓度与该试验研究结果相似。
闪式提取法突出特点为快速、简易地达到提取天然产物,但具体提取条件仍存在差异,例如当料液比增高时会降低溶解在溶剂中的活性物质的传质阻力,进而提高传质速率,从而提高目标化合物的产率,但过量的溶剂会导致更多的杂质溶解使目标产物得率降低[50];当处理时间超过最佳值时会因为热积累或者导致颗粒过细,从而导致提取物黄酮得率在提取时间到达最佳后未出现显著差异[38],上述过程会导致目标化合物的损失,这与该单因素试验趋势相同。该试验结果表明,响应面法优化闪式提取何首乌不定根总黄酮最优工艺为提取时间51.90 s,溶剂浓度65.1%,液料比51.8∶1 (mL∶g),当何首乌不定根粗提物浓度为0.5 mg/mL时,DPPH自由基清除率达到75%,当浓度为2 mg/mL时,对ABTS自由基清除率达到99 %。