万古霉素诱导人肾小管上皮细胞损伤及其Smad4 表达的研究

高瑞，肖晓琳，许建春，宋玮*

1.天津市第五中心医院 药剂科，天津 300450

2.天津市第五中心医院 中心实验室，天津 300450

肾脏疾病分为急性肾损伤和慢性肾脏疾病2 种类型。急性肾脏损伤通常起病急，于7 d 内肾脏功能减退。由于肾功能损伤程度不同，临床表现为血肌酐极微量的升高，以及无尿的急性肾功能衰竭。急性肾功能衰竭是重症患者死亡的主要原因之一，因急性肾衰竭死亡的重症患者人数可达到50%[1]。据统计约20%急性肾脏损伤是药物毒性引起，其中抗生素导致的肾损伤最为常见。万古霉素能有效治疗革兰阳性菌，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的感染，在危重患者的抗感染治疗中具有重要地位。然而，万古霉素作为首选药的同时所导致的不良反应限制该药物在临床的广泛应用，其中最主要的不良反应为急性肾脏损伤[2-4]。

万古霉素引起急性肾损伤的机理目前还远未明确。研究表明，万古霉素引起肾损伤可能与万古霉素诱导的肾小管上皮细胞引起的氧化应激[5]、细胞自噬[6]、阻塞性管型形成[7]和基因调控[8-9]等因素有关。还有研究证实万古霉素引起肾损伤还可能与其有抑制P-糖蛋白（P-gp）功能和P-gp 在细胞膜上的表达相关[10]。

除上述机制外，研究还发现，Smad 介导的转化生长因子-β（TGF-β）途径是调控肾脏疾病中多种病理过程的重要信号通路[11]。Smad 蛋白家族根据其结构与功能分3 个亚型：调节型、共享型、抑制型蛋白。其中，Smad4 是哺乳动物中唯一存在的共享型Smad 蛋白。Smad4 作为受体调节型Smad 蛋白共同结合体，影响Smad2/3 在胞浆和胞核中的定位，在肾脏疾病中具有重要作用，且Smad4 在肾脏纤维化和肾脏炎症中发挥截然相反的作用[12]。Tsuchida等[13]证实肾小球系膜细胞内Smad4 截短突变可抑制TGF-β 诱导的细胞外基质沉积。Meng 等[14]指出肾小管上皮细胞特异性敲除Smad4 基因能抑制Smad3 反应启动活性，降低Smad3 和靶基因的结合能力，进而减弱单侧输尿管结扎诱导的肾脏纤维化；然而敲除Smad4 基因后Smad7 转录受到抑制，Smad7 蛋白表达减少，进而抑制靶基因核因子κB（NF-κB）的抑制蛋白（IκB）表达，促进肾脏炎症反应。目前关于Smad4 蛋白在万古霉素诱导的急性肾脏损伤中的作用尚无报道。实验通过研究万古霉素诱导人肾小管上皮细胞损伤及其Smad4 的表达，希望能为对抗万古霉素肾毒性寻找新的作用靶点。

1 试剂与仪器

HK-2 细胞购自美国ATCC 公司。

万古霉素（货号V2002）购自美国Sigma 公司。DMEM/F-12 培养基（货号11330032）、胎牛血清（货号10091-148）、胰蛋白酶（货号25200-056）均购自美国Gibco 公司，Anti-Smad4（货号ab244370）、Anti-B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）（货号ab272102）、Anti-Bcl-2 相关X 蛋白（Bax，货号ab10813）、Anti-βactin（货号ab227387）抗体均购自美国Abcam 公司，辣根过氧化物酶（HRP）二抗购自美国Jackson公司。CCK-8 试剂盒（货号CA1210）、TUNEL 试剂盒（货号T2191）均购自索莱宝公司，Smad4 过表达质粒[pcDNA3.1(+)-Flag-Smad4，PPL00733-2b]购自PPL 质粒与蛋白共享库。

二氧化碳培养箱购自美国Thermo scientific 公司，电泳仪、转膜仪购自英国Cleaver scientific 公司，倒置荧光显微镜购自日本Olympus 公司，全自动酶标仪购自美国BIO-TEK 公司，台式高速离心机、低温高速离心机购自德国Eppendorf 公司，脱色摇床购自北京沃德生物医学仪器公司，超纯水仪购自德国Merck Millipore 公司。

2 方法

2.1 显微镜观察万古霉素对HK-2细胞形态的影响

HK-2 细胞使用DMEM/F12 培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青链霉素和100 μg/mL 链霉素），于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱内培养。取对数生长期的HK-2 细胞接种于6 孔板，经含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培养基同步静止12 h 后，加入不同浓度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的万古霉素处理24 h，观察不同浓度万古霉素对HK-2 细胞形态的影响。

2.2 CCK-8 法检测万古霉素对HK-2 细胞活力的影响

HK-2 细胞使用DMEM/F12 培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青链霉素和100 μg/mL 链霉素），于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱内培养。取对数生长期的HK-2 细胞接种于3 块96 孔板，经含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培养基同步静止12 h 后，分别加入不同终浓度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的万古霉素依次处理6、12、24 h 后，分别加入浓度为10%的CCK-8 溶液，继续培养2 h，取出96 孔板，在酶标仪上检测各孔在波长为450 nm 处的吸光度（A）值。同时折算出存活率作图分析。

2.3 TUNEL 染色检测细胞的凋亡情况

取对数生长期的HK-2 细胞接种于6 孔板（底部放置多聚赖氨酸包被的盖玻片），经含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培养基同步静止12 h 后，加入不同终浓度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的万古霉素处理24 h 后用4%多聚甲醛固定，3%双氧水封闭10 min，0.1% Triton-100 穿透3 min，用原位细胞死亡监测试剂盒监测，用TUNEL 反应混合液标记凋亡细胞，细胞核用4′,6-二脒基-2 苯基吲哚（DAPI）染色，荧光显微镜随机获取图像，并检测细胞凋亡情况。

2.4 蛋白质印迹（Western blotting）检测HK-2 细胞中Smad4 蛋白的表达

取对数生长期的HK-2 细胞接种于6 孔板，经含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培养基同步静止12 h 后，加入不同终浓度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的万古霉素处理24 h，收集蛋白。将等量的蛋白裂解物在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%的牛奶室温封闭l h，在4 ℃用不同的一抗对膜进行过夜孵育，将一抗清洗干净，用二抗在室温孵育l h，通过增强化学发光液ECL 并使用C-Digit 印迹扫描仪成像，检测Smad4 的蛋白表达水平。

2.5 Western blotting 检测HK-2 细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 的表达

取对数生长期的HK-2 细胞接种于6 孔板，经含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培养基同步静止12 h 后，加入不同终浓度的万古霉素（0、1、2、3、4、5 mmol/L）处理24 h，收集蛋白。按2.4 项下方法，通过增强化学发光液ECL 并使用C-Digit 印迹扫描仪成像，检测Bax 和Bcl-2 的蛋白水平的表达，采用Image PRO Plus 6.0 分析软件测定相关蛋白条带的灰度值。

2.6 过表达Smad4 质粒转染及验证

根据lipofectamineTM2000（invitrogen）说明书操作步骤，将pcDNA3.1(+)-Flag-Smad4 过表达质粒转染至HK-2 细胞48 h，收集细胞，提取总蛋白质。通过Western blotting 验证Smad4 的过表达情况。同时设置空载对照组。

2.7 过表达Smad4 对HK-2 细胞损伤的影响

取上述转染48 h并验证Smad4过表达后的HK-2 细胞，随机分为对照组（DMEM/F-12 培养基）、万古霉素2 mmol/L 组。同时空载组也随机分为对照组（DMEM/F-12 培养基）、万古霉素组（2 mmol/L），共同培养24 h，显微镜下观察HK-2 细胞形态变化情况；同时将上述分组细胞用4%多聚甲醛固定，3%双氧水封闭10 min，0.1% Triton-100 穿透3 min，用原位细胞死亡监测试剂盒监测，用TUNEL 反应混合液标记凋亡细胞，细胞核用4′,6-二脒基-2 苯基吲哚染色，荧光显微镜获取图像，检测万古霉素诱导的过表达HK-2 细胞凋亡情况。

2.8 统计学分析

本研究所得数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。

3 结果

3.1 显微镜下观察万古霉素对HK-2 细胞形态的影响

显微镜下显示，随着万古霉素浓度的逐渐升高，HK-2 细胞的活性细胞数量逐渐变少，细胞体积逐渐萎缩变圆，而细胞凋亡数量逐渐增多，如图1所示。

图1 万古霉素对HK-2 细胞形态的影响（×100）Fig.1 Effect of vancomycin on HK-2 cell morphology (× 100)

3.2 CCK-8 法检测万古霉素对HK-2 细胞存活率的影响

结果显示，随着万古霉素浓度升高，作用时间增长，HK-2 细胞增殖能力逐步降低；与6 h 组相比，12 h 组不同浓度万古霉素对HK-2 细胞存活无显著影响，而24 h 组不同浓度万古霉素可显著抑制HK-2 细胞存活（P＜0.05、0.01），见图2。

图2 万古霉素对HK-2 细胞活力的影响（，n =3）Fig.2 Effect of vancomycin on the viability of HK-2 cells(,n =3)

3.3 TUNEL 染色检测细胞凋亡

结果显示，随着万古霉素浓度升高，TUNEL 阳性细胞逐渐增多，见图3。

图3 万古霉素对HK-2 细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of vancomycin on apoptosis of HK-2 cells

3.4 Western blotting 检测HK-2 细胞Bax、Bcl-2、Smad4 蛋白的表达

免疫蛋白印迹结果显示，与对照组相比，随着万古霉素浓度升高，Bax 蛋白表达显著升高，Smad4、Bcl-2 表达显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），见图4、5。

图4 万古霉素对HK-2 细胞中Smad4、Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响Fig.4 Effects of vancomycin on Smad4,Bax,and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells

图5 HK-2 细胞中Smad4、Bax、Bcl-2 蛋白表达量化结果（，n =3）Fig.5 Quantitative results of Smad4,Bax,and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells (,n =3)

3.5 过表达Smad4 对万古霉素诱导的HK-2 细胞损伤的影响

Western blotting 检测HK-2 细胞中Smad4 蛋白的表达水平。与对照组相比，发现Smad4 过表达的HK-2 细胞中Smad4 蛋白表显著增高（P＜0.01），见图6。

图6 HK-2 细胞中构建的过表达Smad4 蛋白表达情况（，n =3）Fig.6 Expression of overexpressed Smad4 protein constructed in HK-2 cells (,n =3)

显微镜下显示，空载对照组HK-2 细胞状态良好，呈正常梭形、背景清晰，贴壁正常；空载万古霉素2 mmol/L 组HK-2 细胞失去正常形态，出现较多凋亡小体，活性细胞数量减少，凋亡数量明显增多。转染对照组细胞形态较好，基本无凋亡；转染万古霉素2 mmol/L 组HK-2 细胞与空载万古霉素2 mmol/L 组相比，活性细胞数量增多，凋亡数量减少，见图7。TUNEL 法检测过表达HK-2 细胞凋亡情况，发现荧光显微镜下，与空载对照组相比，转染组阳性凋亡HK-2 细胞数量无显著变化；空载万古霉素2 mmol/L 组阳性凋亡HK-2 细胞数量显著增多（P＜0.001）。与空载万古霉素2 mmol/L 组相比，转染万古霉素2 mmol/L 组阳性凋亡HK-2 细胞数量显著减少（P＜0.05），见图8。

图7 过表达Smad4 对万古霉素诱导的HK-2 细胞损伤的形态学变化（×100）Fig.7 Morphological changes of vancomycin-induced HK-2 cell injury induced by overexpression of Smad4 (× 100)

图8 万古霉素诱导对过表达Smad4 的HK-2 细胞凋亡情况的影响（，n =3）Fig.8 Effect of vancomycin induction on apoptosis of HK-2 cells overexpressing Smad4 (,n =3)

4 讨论

万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起严重感染的一线抗生素，然而肾毒性是万古霉素治疗常见的不良反应[15]。万古霉素可诱导急性肾损伤逐渐转变为慢性肾病，在早期主要表现为肾功能不全和肾细胞凋亡，在后期肾脏纤维化和炎症明显加重[16]。

本研究通过加入不同浓度的万古霉素处理HK-2 细胞，发现万古霉素抑制HK-2 细胞的细胞活力，促进促凋亡蛋白Bax 表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制HK-2 细胞中Smad4 蛋白表达，且呈剂量相关性。研究结果表明，万古霉素可能通过调控Smad4 蛋白降解导致急性肾脏损伤。

此外，Smad 蛋白家族是TGF-β 下游最重要的信号转导蛋白，在调节细胞的增殖、分化、迁移等过程中发挥重要作用。Shen 等[17]研究发现抑制Smad4 信号通路可发挥抗纤维化作用。另外，氧化应激在急慢性肾损伤的发展过程中起着关键作用，醉茄素A 可通过抑制Smad4 表达，降低TGF-β 及其下游信号分子水平，对肾损伤模型大鼠具有潜在的肾保护作用[18]。Zhang 等[19]研究发现大黄可通过抑制TGF-β/Smad 通路，改善慢性肾脏疾病异常代谢，预防肾损伤。本研究还发现，过表达Smad4 可降低万古霉素诱导的HK-2 细胞的损伤，再次提示万古霉素可能通过调控Smad4 蛋白降解导致急性肾脏损伤。

综上所述，万古霉素可能通过调控Smad4 蛋白降解导致急性肾脏损伤，为对抗万古霉素肾毒性寻找了新的作用靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突