基于网络药理学和实验验证探讨瓜蒌皮注射液治疗动脉粥样硬化的作用机制

高锟，朱春胜，于东升，李晓萍

郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

动脉粥样硬化是血管内膜内各种细胞、脂质和碎片组织形成斑块的过程，是一种由传统和非传统危险因素介导的慢性血管炎症[1]。临床大量研究表明动脉粥样硬化是心血管疾病的病理基础，其中不稳定的动脉粥样硬化斑块破裂、血小板聚集、血栓形成引起血管狭窄或闭塞，是导致心肌梗死、缺血性心肌病、中风和外周动脉疾病等心血管疾病的主要因素[2-3]。美国国家健康与营养检查数据显示，2005—2008 年美国高低密度脂蛋白胆固醇的总体人口患病率已达33.5%[4]。《中国心血管健康与疾病报告2019》指出，我国目前心血管病患病率处于逐年上升阶段，患病人数已达3.3 亿人，且平均每5例死亡病例中就有2 例死于心血管病[5]。因此，开展动脉粥样硬化的治疗对防治心血管病带来的风险显得尤为重要。

瓜蒌皮注射液是由瓜蒌皮提取纯化制成的中药注射剂，目前已被广泛应用于冠心病、不稳定型心绞痛、冠脉介入术后等心血管疾病的临床治疗[6]。然而瓜蒌皮注射液对心血管疾病的前期动脉粥样硬化是否有影响还未见相关报道。中药产生的药效是多靶点、多成分的综合效应，其生物活性及其分子机制非常复杂，如何避免中药多成分割裂式的研究，构建反映中药“整体性”特色的药效成分筛选模式是一个值得不断深入探索的科学问题[7]。随着生物信息学的发展，网络药理学能从多成分、多靶点、多途径层面系统阐述中药发挥药效的物质基础和作用机制，较好地体现了中医的“整体观”，已逐步获得了业内人士的认可[8-9]。因此，本研究将结合网络药理学和动物实验，从体内外2 个维度探讨了瓜蒌皮注射液治疗动脉粥样硬化的物质基础和作用机制，以期为瓜蒌皮注射液向临床深入推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 瓜蒌皮注射液化学成分与潜在靶点筛选 以“ 瓜蒌皮注射液”“ Trichosanthis Pericarpium Injection”“Gualoupi Injection”为关键词，在CNKI、万方数据库、PubMed 数据库检索并收集有关瓜蒌皮注射液的化学成分文献报道。将上述获得的化合物导入PubChem 数据库下载化合物2D 结构的SDF图，并导入Swiss ADME 数据库，以胃肠道吸收度（GI absortion）为“High”和满足类药性五原则lipinski、ghose、veber、egan、muegge 其中的2 个或2 个以上为条件再次筛选。同时，将上述符合条件的化合物导入到Swiss Target Prediction 数据库中检索相应的靶点，收集靶点信息。

1.1.2 动脉粥样硬化靶点检索及“药物-成分-靶点”网络构建 在OMIM、TTD、Gene Cards 3 个数据库中输入关键词“atherosclerosis”进行检索，汇总与动脉粥样硬化相关的靶点，并结合Uniprot 蛋白库对上述靶点进行标准化处理，构建动脉粥样硬化靶点数据库。

将瓜蒌皮注射液活性成分与瓜蒌皮注射液-动脉粥样硬化相关靶点使用Cytoscape 3.6.1 软件，构建“药物-成分-靶点”相互作用网络图，使用Network Analyzer 功能对瓜蒌皮注射液的主要活性成分进行拓扑性质分析，根据degree 值进行排序，以获得瓜蒌皮注射液活性成分成分和靶点的网络图。使用Venny 2.1 软件将1.1.1 项下瓜蒌皮注射液活性成分预测靶点和动脉粥样硬化靶进行匹配，绘制共同靶点韦恩图，获得瓜蒌皮注射液治疗动脉粥样硬化的共有靶点。

1.1.3 基于String 的蛋白相互作用网络（PPI）构建 将瓜蒌皮注射液和动脉粥样硬化共有靶点输入到String 数据库，限定物种为“Homo sapiens”进行检索，以获得PPI 图，同时通过degree 值来筛选瓜蒌皮注射液治疗动脉粥样硬化的核心靶点。

1.1.4 通路富集分析 将瓜蒌皮注射液和动脉粥样硬化共有靶点输入DAVID 数据库，限定物种为“Homo sapiens”，进行关键靶点基因本体（GO）生物学富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路富集分析。利用微生信在线绘图工具对GO 分析结果中的生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）以及KEGG 结果作可视化处理。

1.2 动物实验验证

1.2.1 药品与试剂 瓜蒌皮注射液购自上海上药第一生化药业有限公司，规格4 mL/瓶，批号2 103201；三酰甘油（TG）试剂盒（批号141722012）、总胆固醇（TC）试剂盒（批号141622014）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号142122013）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒（批号142022013）均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；蛋白激酶B1（Akt1）抗体（批号51077-1-AP）、p-Akt1 抗体（批号28731-1-AP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批号66470-z-Ig）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）抗体（批号11097-1-AP）均购自美国Proteintech 公司，p-SRC 抗体（批号595485）购自美国CST 公司。

1.2.2 主要仪器 BS-240VET 全自动生化分析仪（深圳迈瑞公司）；石蜡组织切片机（美国AO 公司）；Nikon Eclipse E100 型正置光学显微镜（日本Nikon公司）；5430R 低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；YB3002 分析天平（上海力能电子仪器公司）；恒温水浴锅（北京医疗设备厂）。

1.2.3 动物 SPF 级8 周龄雄性Apo E-/-小鼠18 只及相同周龄及遗传背景的雄性C57BL/6J 小鼠6 只，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物中心，动物批号110324210106099213，许可证号SCXK（京）2019-0010。实验期间全程喂养于动物实验中心适应1 周，室内温度22～25 ℃，相对湿度40%～45%。本实验获得郑州大学第一附属医院生命科学伦理委员会批准，批号2023-KY-1400

鉴于施工图纸设计的复杂性的自身特征，对于总体工作量较大的制图环节，管理人员也应当重视图纸设计的统一规范性和合理性，并通过监管制度的落实，及时发现不合格的图纸资料，对其进行修正处理，确保图纸资料对于实际建筑施工的参考价值。

1.2.4 动物模型建立及分组 Apo E-/-小鼠给予高脂饮食8 周建立动脉粥样硬化小鼠模型，周龄及遗传背景相同的雄性C57BL/6J 对照组小鼠给予普通饮食[10]；高脂饮食饲养7 周后，18 只Apo E-/-小鼠随机分为模型组、瓜蒌皮注射液（0.6、1.2 mL/kg）组，每组6 只。瓜蒌皮注射液组分别im 0.6、1.2 mL/kg 瓜蒌皮注射液，连续给药3 周。

1.2.5 取材 末次给药后，小鼠麻醉后，腹主动脉采血，放于普通试管中，3 000×g离心10 min，分离上清液，用于测定TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平；同时剥离主动脉，部分置于4%多聚甲醛固定用于病理学观察，部分置于液氮用于核心蛋白表达的验证。

1.2.6 观察主动脉组织病理变化 取新鲜主动脉组织，固定液固定组织，固定后清水冲洗，并采用梯度乙醇进行处理，并进行石蜡组织包埋，后经脱蜡、脱水等一系列操作后，伊红染色3 min，脱水封片，显微镜下观察组织病理情况。

1.2.7 蛋白质免疫印迹（Western blotting）法检测核心蛋白表达 称取各组小鼠主动脉组织，加入裂解液提取总蛋白，采用BCA 法对各样本蛋白浓度进行定量。提取的蛋白（20 μg）通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到PVDF 膜上。用5 %脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜（核心蛋白抗体Akt1、Caspase 3、p-SRC 及内参β-actin 稀释比例1∶1 000，p-Akt1 稀释比例1∶2 000，SRC 稀释比例1∶500）。用TBST缓冲溶液洗涤后，二抗孵育1 h。用ECL 显色，Bio-RAD 曝光仪曝光，采集不同时段的显色条带。以βactin 为内参，用Image J 软件对条带的灰度值进行定量分析。

1.2.8 统计学方法 使用GraphPad Prism 8.01（美国San Diego）进行数据处理和分析，结果用表示。使用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，美国）进行Western blotting 分析。

2 结果

2.1 瓜蒌皮注射液主要活性成分的筛选

通过对瓜蒌皮注射液相关文献报道[11-14]的梳理，共搜集瓜蒌皮注射液化学成分63 个，结合Swiss ADME 数据库，以GI absortion 为“High”和满足类药性五原则中的2 个或以上为筛选件，共筛选出包括芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、香草酸等21 个化学成分，见表1。

表1 瓜蒌皮注射液主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Gualoupi Injection

2.2 “药物-成分-靶点”网络

图1 “药物-成分-靶点”网络Fig.1 “Drug -ingredient -target” network

2.3 “瓜蒌皮注射液-动脉粥样硬化”共有靶点预测和PPI 网络构建

将筛选出的21 个瓜蒌皮注射液活性成分的潜在作用靶点与动脉粥样硬化靶点绘制韦恩图，见图2。将上述共有蛋白输入String 数据平台，以获得PPI 网络图，见图3，其中degree 值排名前5 位的潜在靶点包括Akt1、Caspase-3、前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2）、SRC、表皮生长因子受体（EGFR），上述蛋白可能是瓜蒌皮注射液发挥治疗动脉粥样硬化作用的核心靶点。

图2 “瓜蒌皮注射液-动脉粥样硬化”共有靶点维恩图Fig.2 Venn diagram of common targets of “Gualoupi Injection -atherosclerosis”

图3 PPI 网络Fig.3 PPI Network

2.4 GO 生物学功能分析和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析共获得702 条目，其中BP 545 个，CC 67 个，MF 90 个。根据P值＜0.05、FDR＜0.05的条目将前10 位作可视化处理，结果见图4。主要涉及对细胞增殖的调控、细胞凋亡的调控、程序性细胞死亡的调控、细胞死亡的调控等BP 过程，CC包括神经元投射、细胞表面、等离子体膜、轴突等，MF 包括肽酶的活动、钙离子结合、丝氨酸水解酶活性、铁离子结合等。KEGG 通路富集分析共得到42 条信号通路（P＜0.05），选取排名前20 位的信号通路并作可视化分析，结果见图5，提示白细胞介素-17（IL-17）信号通路、神经活性配体-受体相互作用、精氨酸生物合成、花生四烯酸代谢、肾素-血管紧张素系统、核因子-κB（NF-κB）等通路与动脉粥样硬化密切相关。

图4 瓜蒌皮注射液治疗动脉粥样硬化的GO 分析Fig.4 GO analysis of Gualoupi Injection in treatment of atherosclerosis

图5 瓜蒌皮注射液治疗动脉粥样硬化的KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of Gualoupi Injection in treatment of atherosclerosis

2.5 瓜蒌皮注射液对动脉粥样硬化小鼠血脂水平的影响

与对照相比，模型组小鼠血清TC、TG、LDLC 显著升高，HDL-C 显著降低（P＜0.01）；与模型相比，瓜蒌皮注射液组小鼠血清TC、TG、LDL-C均显著降低（P＜0.05、0.01），而对HLD-C 无显著改变，见表2。

表2 瓜蒌皮注射液对动脉粥样硬化小鼠血清TC、TG、LDI-C、HDL-C 的影响（，n =6）Table 2 Effects of Gualoupi Injection on serum TC,TG,LDI-C,and HDL-C of atherosclerosis mice (,n =6)

表2 瓜蒌皮注射液对动脉粥样硬化小鼠血清TC、TG、LDI-C、HDL-C 的影响（，n =6）Table 2 Effects of Gualoupi Injection on serum TC,TG,LDI-C,and HDL-C of atherosclerosis mice (,n =6)

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01。**P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group.

2.6 瓜蒌皮注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉的影响

HE 染色结果显示，对照组小鼠主动脉内膜光滑完整，无斑块形成。模型组小鼠主动脉壁破损，可见较大斑块附着于管壁上，斑块内见少量泡沫细胞。与模型组相比，瓜蒌皮注射液组小鼠主动脉壁较完整，部分可见少量斑块和泡沫细胞附着于管壁上，见图6。

图6 瓜蒌皮注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉的影响Fig.6 Effect of Gualoupi Injection on aorta in mice with atherosclerosis

2.7 瓜蒌皮注射液对核心蛋白的影响

与对照组比较，模型组p-SRC、p-Akt1 蛋白表达水平显著升高，Caspase-3 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，瓜蒌皮注射液组p-SRC、p-Akt1 蛋白表达水平显著降低，Caspase-3 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01、0.05），而SRC、Akt1 蛋白在各组中无显著变化，见图7。

图7 瓜蒌皮注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉核心蛋白的影响（，n =6）Fig.7 Effect of Gualoupi Injection on aortic core protein in atherosclerosis mice (,n =6)

3 讨论

传统中医并无动脉粥样硬化记载，根据其临床症状及病理表现，将其归属于“胸痹”“脉痹”“中风”等范畴[15]。历代医家对动脉粥样硬化的病因病机进行了不同的阐述，《医学正传》记载：“津液稠黏，为痰为饮，积久渗入脉中，血为之浊”，提出痰饮相生而互结，留滞于脉中即可发展为动脉粥样硬化[16]；《医林改错》记载：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”提出气虚血瘀可发展为动脉粥样硬化[17]；冯文伟等[18]根据课题组多年的临床实践经验，提出“脉络积”学说，认为气滞、血瘀、痰浊等积聚内生于脉是形成动脉粥样硬化的核心病机；余锋等[19]根据现代医学对动脉粥样硬化的认识及临床实践，认为形成动脉粥样硬化的病机是“气阳亏虚，血瘀热毒”。可见气虚、痰饮、血瘀是形成动脉粥样硬化的主要病机。而瓜蒌皮注射液作为化痰泄浊类的代表，具有行气除满、开胸除痹之功，现代药理研究亦表明瓜蒌皮注射液具有抗血小板聚集、抗自由基、活血化瘀等作用[20]，但是对动脉粥样硬化的作用机制系统报道较少。

因瓜蒌皮注射液在中药系统药理数据库和分析平台上检索不到相应成分，实验基于文献报道结合胃肠道吸收度为“High”和满足类药性五原则中的2 项作为瓜蒌皮注射液活性成分的筛选，共筛选出包括芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、香草酸、亮氨酸、烟酸等21 个成分。Ashokkumar 等[21]发现香草酸可引起除血浆HDL 水平升高外的相当大的脂质谱降低，此外，还可以减少肝组织中胶原蛋白的积累。孙霁寒等[22]研究发现木犀草素可以通过降低高脂血症大鼠的TC、TG、LDL-C 水平，升高过氧化氢酶来发挥抗氧化应激作用，减轻肝细胞脂肪在肝脏的沉积。李志乐等[23]研究发现烟酸可通过显著提高主动脉B7-H3、B7-H4 蛋白表达，调控血脂TC、TG、LDL-C 和炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、γ 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-10（IL-10）水平，从而发挥治疗动脉粥样硬化药效。本实验结果表明瓜蒌皮注射液可显著降低动脉粥样硬化小鼠血清TC、TG、LDL 水平，HE 染色显示瓜蒌皮注射液还可减少斑块和泡沫细胞主动脉管壁上的黏附，提示瓜蒌皮注射液可能是通过上述多个成分减少血脂在血管中蓄积进而发挥治疗动脉粥样硬化作用。

PPI、GO、KEGG 结果显示，瓜蒌皮注射液通过调节Akt1、Caspase-3、SRC 等在内的多个活性靶点，从细胞表面、等离子体膜、轴突等层面影响肽酶的活动、钙离子结合、丝氨酸水解酶活性进而干预对细胞增殖的调控、细胞凋亡的调控、程序性细胞死亡的调控等过程，最终通过调控IL-17 信号通路、花生四烯酸代谢、NF-κB 等多个通路发挥治疗动脉粥样硬化。有研究显示，Akt1 基因的缺失会导致小鼠体生长迟缓，伴随着多个器官的缩小，限制性细胞类型的细胞凋亡水平升高[24-25]，同时还表现出胚胎外血管模式受损和胎盘萎缩，以及围产期高胎儿死亡率[26]。此外，Akt1 可通过参与调节一氧化氮合成酶和一氧化氮的生成，对动脉粥样硬化斑块具有保护作用[27]。近年来随着人们的深入研究，发现Caspase-3 可通过介导细胞焦亡引起炎症反应，进而参与心血管疾病的发生和发展[28]。而Caspase-3 作为细胞凋亡的终末蛋白，其升高与动脉粥样硬化、心肌病、心肌缺血等密切相关[29]。在3 221 名受试者研究中，发现Caspase 3 与冠状动脉钙化、主动脉壁厚度、主动脉顺应性独立相关，提示Caspase-3 与动脉粥样硬化之间存在联系[30]。SRC 是人类发现较早的一类由多种胞外信号分子激活的非跨膜型蛋白，包括9 种结构相似的家族成员，有研究发现SRC 参与了细胞中多种活动，如细胞增殖、迁移、脂质代谢等[31]。Ba 等[32]发现红景天苷可通过增强SRC的活性和Caveolin-1的自噬降解来抑制LDL胞吞作用从而预防动脉粥样硬化。Western blotting研究发现，与对照组比较，模型组p-SRC、p-Akt1蛋白表达水平显著升高，Caspase-3 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；瓜蒌皮注射液可逆转上述蛋白的表达（P＜0.01、0.05），而对SRC、Akt1 蛋白表达无显著影响，说明瓜蒌皮注射液发挥抗动脉粥样硬化的作用机制可能与调控 p-SRC、p-Akt1、Caspase-3 的蛋白表达有关，同时也间接证实网络药理学筛选核心蛋白的合理性。

综上，本研究采用网络药理学整合动物实验探讨瓜蒌皮注射液治疗动脉粥样硬化的作用机制，发现瓜蒌皮注射液可能通过芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、香草酸等多个成分调控Caspase-3、p-SRC、p-Akt1 等靶标蛋白，降低TC、TG、LDL 血脂水平，减少斑块在主动脉附着，进而发挥治疗动脉粥样硬化。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突