细胞外游离组蛋白在脓毒症发生发展及治疗中的作用研究进展

耿凡毅，刘虹

1 山西医科大学第一临床医学院，太原 030000；2 山西医科大学第一医院重症医学科

脓毒症是一种重症监护室的常见临床综合征，是由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍［1］。全球每年约有4890 万脓毒症患者，受不同地区医疗水平影响，全球死亡率约为52.8%［2］。目前脓毒症的发病机制尚未完全明了，主要认为与病原微生物的清除障碍、炎症反应失衡、线粒体损伤、凝血功能障碍、氧化应激等有关，治疗仍以早期识别、抗感染、生命支持为主。组蛋白在传统上被认为是真核生物细胞染色质与原核细胞中的碱性蛋白质和DNA 共同组成核小体结构，是染色质的主要蛋白质成分。但是近10年逐渐发现了细胞核外游离组蛋白（cell-free histones， CFHs）的存在，在脓毒症发生发展时，中性粒细胞通过形成中性粒细胞诱捕网（Neutrophil extracellular trap， Nets）来捕获病原体，其中CFHs是NETs的重要组成部分，而且细胞凋亡坏死导致核膜破裂也会释放组蛋白至细胞外形成CFHs。CFHs 在介导脓毒症的炎症反应、内皮功能障碍等方面的免疫病理学作用被不断研究，并被认为是脓毒症患者有希望的免疫调节靶点，现将CFHs 在脓毒症的发生发展及治疗中的作用研究进展综述如下，为今后脓毒症的治疗提供新的思路和方向［3-4］。

1 CFHs在脓毒症发生发展中的作用

脓毒症时CFHs 的含量增多，会引起机体器官功能的损伤，作为脓毒症发生发展的重要介质，目前认为CFHs 的抗菌效果及细胞毒性、促进炎性因子的释放、通过多种方式损伤内皮细胞、促进血小板的聚集和凝血的活化等作用，与脓毒症的多器官功能障碍密切相关。

1.1 抗菌和细胞毒性 感染是脓毒症发生的前提，引起脓毒症严重感染的病原体通常包括细菌、病毒、真菌等，感染的控制是脓毒症的主要治疗方法。CFHs 发挥其抗菌作用最早在1958年被报道，JAMES等［5］人经过研究发现CFHs可以杀死病原体，但当时认为细胞内组蛋白的基因表达调控作用是最主要的，CFHs 的杀菌作用被忽略掉。随后在2004年发现了Nets，CFHs 作为NETs 的重要组成部分之一，才引起了人们对组蛋白在免疫方面的作用的兴趣。在随后的多项试验中，CFHs之一的瓜氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）表现出对革兰氏阴性菌（产气肠杆菌、肠沙门氏菌和铜绿假单胞菌）、革兰氏阳性菌（蜡样芽孢杆菌和变形链球菌）和一种真菌菌株（白色念珠菌）有抗菌活性，实验证明CFHs 可以与病原体表面分子结合，随后对病原体细胞膜产生破坏而发挥CFHs的抗菌作用，同时它的细胞毒性也是通过破坏细胞膜所实现的［6-7］。考虑到CFHs 在宿主防御阶段的抗菌及细胞毒双重作用，未来也有希望开发基于CFHs的无细胞毒性抗菌药物来进行脓毒症的治疗。

1.2 参与炎症反应 当组蛋白从细胞核释放到细胞外形成CFHs 时，被认为具有重要的促炎功能［8］。CFHs 通过激活TLRs，如TLR2、TLR4 和TLR9，或结节样受体蛋白（NLPR3）炎症反应途径引发先天免疫，导致促炎细胞因子IL-1、IL-1B、IL-6、IL-18、TNF等的释放，进而使中性粒细胞释放Nets，且上调组织因子（TF）的表达［9-10］。HSIEH 等［11］人研究发现，游离组蛋白H4 在感染或炎症部位的释放可能会增强中性粒细胞的活化并促进额外的炎症反应。XU等［12］人报道过CFHs 是脓毒症小鼠死亡的主要介质，但是该实验没有对脓毒症小鼠体内炎症因子进行进一步研究，后续再次进行实验后，发现在小鼠体内注射亚致死剂量CFHs 导致了高水平的TNF-α、IL-6 和IL-10，但是TLR4 和TLR2 基因敲除的小鼠却能抵抗致死剂量CFHs 的打击，该实验充分证明了CFHs在TLRs介导下的免疫炎症反应。

1.3 引起内皮细胞损伤 内皮损伤会导致液体渗漏和白细胞的聚集，被认为是脓毒症器官和组织损伤的主要原因。有学者［13］研究发现，正常的核小体不具有细胞毒性，但被降解后的核小体会释放CFHs对内皮细胞产生了细胞毒性。另外，CFHs对细胞膜磷脂中的磷酸二酯键的强亲和力促进其整合到膜中，进一步加重内皮细胞损伤。也有学者［14］发现，Cit-H3 作为一种CFHs，可通过对细胞黏着连接的开放和细胞骨架的重组作用损伤内皮细胞。MONA等人将Nets 的组成部份（中性粒细胞弹力蛋白酶、髓过氧化物酶、CFHs）分别作用于肺泡上皮细胞及内皮细胞，以观察各组分对细胞的直接影响，发现了CFHs诱导了上皮细胞和内皮细胞的死亡，而单独抑制中性粒细胞弹力蛋白酶并不能抑制Nets 介导的细胞毒性［15］。其次，在血浆中CFHs 会增大钙离子向内皮细胞内流，引起内皮细胞死亡和血管功能障碍［16］。SILVESTIR 等［17］人也发现，细胞外游离组蛋白H4 可通过在血管平滑肌细胞的细胞膜上形成孔洞而导致细胞裂解，从而导致血管组织损伤。

1.4 导致凝血功能障碍 脓毒症期间会引起严重的凝血功能障碍，凝血系统的激活被认为是人体对病原体入侵的初始免疫应答的一部分，可以触发先天防御机制，TF 是凝血的主要发起者。CFHs 通过钙离子内流、细胞间缝隙链接断裂破坏内皮细胞屏障，使原本存在于细胞质膜的TF暴露于循环FVII因子，使FVII因子与TF结合，生成FXa因子，启动凝血级联反应。CFHs还可以通过TLRs信号通路诱导单核细胞和内皮细胞内的TF 表达，甚至可以直接与FXa 因子结合而产生不需要磷脂的凝血酶原，形成一种替代凝血酶原复合物的物质［18-19］。目前有研究［20］显示，血小板也参与了先天性免疫反应，脓毒症期间血小板反应性增加，血小板所具有的DAMPs会被毒素所激活，从而导致机体凝血系统的紊乱，进一步导致出血或血栓的形成。血小板对感染的反应研究最重要之一就是血小板与中性粒细胞相互作用，Nets 为血栓的形成提供了一个支架和刺激，其中CFHs 可以通过TLR2 和TLR4 途径刺激脓毒症期间血小板的聚集［12，21］。另外，细胞外游离组蛋白H3、H4 触发NLRP3 炎症小体信号转导和血小板中caspase-1的裂解，这也可能导致随后的血栓形成［22］。

2 CFHs作为脓毒症潜在治疗靶点

CFHs 参与了脓毒症的发生发展过程，因此将CFHs 作为脓毒症潜在治疗靶点具有一定可行性。目前的实验研究中出现了抑制CFHs 的产生、降解循环中的CFHs 或使用降低CFHs 细胞毒性的药物等方法，因此以CFHs 作为治疗靶点有望会成为脓毒症治疗的新策略。

2.1 抑制CFHs 的产生发挥治疗作用 CFHs 的重要产生方式之一与NETs 有关。NETs 释放CFHs 是由于细胞内组蛋白在肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）催化下进行瓜氨酸化，形成瓜氨酸化组蛋白，导致染色质解螺旋使得组蛋白释放至细胞外形成CFHs。PAD 抑制剂氯—嘧啶可以抑制PAD4 的生成，间接抑制组蛋白瓜氨酸化从而抑制CFHs 的产生。实验［23］表明，氯—嘧啶可以显著降低脓毒症兔子的AKI 评分、血肌酐、血尿素氮水平，证实了抑制CFHs的产生在脓毒症治疗中的潜力。

2.2 降低循环中CFHs 的含量发挥治疗作用 在致死性脂多糖诱导休克的小鼠模型中，用新开发的抗CitH3单克隆抗体中和CitH3 可减弱炎症反应、器官损伤，改善急性肺损伤并提高存活率，因此减少循环中的CFHs 可能是治疗脓毒症的潜在治疗方法［7，24］。

CFHs 对脓毒症的凝血级联的影响可以通过利用活化蛋白C（APC）、血栓调节蛋白（TM）来应对。在脓毒症狒狒上使用APC，发现其可以降解细胞外游离组蛋白H3、H4，其作用可能是通过APC 切割组蛋白并降低了CFHs的细胞毒性来实现的［25］。TM是一种主要表达于内皮细胞表面的抗凝蛋白，既往研究揭示了TM 的抗炎和细胞保护作用。有研究采用重组人血栓调节蛋白（RTM）显著降低了细胞外游离组蛋白H3 水平并改善肾损伤，RTM 组脓毒症小鼠存活率也明显升高［26-27］。

肝素对CFHs 有很高的亲和力，但仅限于普通肝素及低分子肝素，类肝素磺达肝癸钠则表现出了低亲和力［28］。当使用肝素这种能去除CFHs 的抗凝剂时，它能像脱氧核糖核酸酶一样有效的拆除Nets并从Nets 中去除血小板聚集物，表明肝素可以通过拮抗CFHs 而不是抗凝血来保护脓毒症小鼠免受器官损伤和死亡［29］。在脓毒症小鼠模型中，肝素已经被证明与CFHs 结合并中和其细胞毒性［30］。它具有一部分抗炎效果，这取决于它的硫酸化水平，实验证明完全去除硫酸基团的肝素并不具有与组蛋白结合的能力，意味其抗凝血效果和抗炎效果是分开的［31］。基于此，KARIN 等［32］人通过层析法从普通肝素中去除抗凝血剂部分，开发了非抗凝剂肝素（AADH），他们的结果表明，AADH 显著结合CFHs，预防组蛋白介导的细胞毒性，并降低小鼠模型脓毒症的死亡率；更重要的是，用AADH治疗正常小鼠的剂量是普通肝素的5 倍，并没有显著延长小鼠出血时间。目前肝素对CFHs 的作用在动物试验中开展较多，临床上危重患者的凝血功能大多存在障碍，凝血时间延长及DIC 的出现，对于肝素在临床上的应用保持慎重的态度，AADH 是否可以应用在临床预防组蛋白的毒性，可以作为新的研究方向。

目前也出现了血液灌流靶向吸附CFHs 的治疗方法，细胞因子吸附器、肝素化吸附器，都可以显著降低脓毒症患者血液中循环CFHs 水平，为脓毒症患者的异常免疫应答的调节提供新的见解［33］。

2.3 降低CFHs的细胞毒性发挥治疗作用 C-反应蛋白（CRP）在抵抗细菌感染的先天免疫中起着重要的防御作用。CFHs会引起钙离子向细胞内流动，而产生细胞毒性，CRP 可以竞争性地结合组蛋白与磷脂脂质体，形成CRP-组蛋白复合物，防止CFHs进入细胞膜并防止钙内流，因此脓毒症患者高水平的CRP具有对循环CFHs的解毒作用，可以一定程度的抵御CFHs 产生的细胞毒性［13，16］。研究［15，34］发现，CFHs的毒性可能是由于其阳离子的特性导致，而利用聚唾液酸（高负电荷的聚糖）可以有效降低Nets介导的CFHs细胞毒性。

综上所述，脓毒症目前仍是重症监护室中的常见综合征，发生机制尚未完全明确，其病理生理过程复杂。随着Nets的不断研究，CFHs也越来越被人们所认识，它在脓毒症中以游离的形式从多个方面对机体进行作用，具有一定抗菌效果，也会发挥细胞毒性、加剧炎症反应促进炎性因子的释放、通过多种方式损伤血管内皮细胞、影响凝血功能导致出血风险或血栓形成，以此延长脓毒症的病程、加重病情。由于CFHs 密切参与了脓毒症的发生发展，各种以CFHs为靶点的治疗手段也得到了很大的进步，抑制CFHs的产生、降解循环中的CFHs或降低CFHs细胞毒性的药物在脓毒症动物模型中提供了显著的预防死亡的作用，发挥了治疗作用，但由于缺乏可靠临床证据，目前可用的抗组蛋白药物均未被任何临床指南批准用于治疗危重疾病的免疫调节，未来应进行更深入研究以开发其潜在的临床价值。