2015年5月—2021年12月于菏泽市出生的296 106例新生儿希特林蛋白缺乏致肝内胆汁淤积症的筛查

刘畅，房振楠，赵芬，汪玉锋，徐龙芳，王广荣，王庆华

1 青岛大学附属青岛妇女儿童医院儿保科，山东青岛 266000；2 菏泽市妇幼保健院儿保科；3 菏泽市妇幼保健院产科；4 菏泽市妇幼保健院新生儿疾病筛查诊治中心；5 菏泽市妇幼保健院检验科

希特林蛋白缺乏导致肝内胆汁淤积症属于希特林蛋白缺乏症的一种类型，该类型多于新生儿晚期起病［1］，有部分患儿可因严重肝硬化或严重感染等并发症死亡，若早期诊断并干预治疗，多数患儿在1岁左右临床症状及体征将会消失。文献［2］报道，早期诊断和饮食干预是改善希特林蛋白缺乏导致肝内胆汁淤积症患儿预后的关键。研究［3-6］显示，亚洲地区根据SLC25A13 基因变异率预测希特林蛋白缺乏症的患病率为1/38 000～1/7 100，而通过新生儿筛查发现确诊的仅有1/82 352［7］，说明肝内胆汁淤积症患儿在新生儿期存在漏诊。随着应用串联质谱法筛查遗传代谢病的普及，肝内胆汁淤积症也被作为新生儿筛查疾病的病种之一，但筛查敏感性问题一直在探讨中。肝内胆汁淤积症早期可出现串联质谱检测结果中瓜氨酸显著升高，但若仅根据瓜氨酸是否显著升高来排除诊断存在假阴性患儿。本研究采集2015 年5 月—2021 年12 月菏泽市出生的296 106 例新生儿足跟血，分别采用初筛手段（液相色谱串联质谱检测）和复筛手段［液相色谱串联质谱、气相色谱质谱、血甲胎蛋白（AFP）、SLC25A13 基因检测］筛查新生中希特林蛋白缺乏导致肝内胆汁淤积症，并分析比较筛查结果及筛查手段，旨在为提高此病的筛查提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015 年5 月1 日—2021 年12月31 日菏泽地区出生的新生儿296 106 例。筛查时间：所有新生儿均为产后72 h 或至少充分哺乳6 次后筛查。所有患儿监护人均在知情同意下自愿进行检测，本研究经菏泽市妇女儿童医院医学伦理委员会审批，批准号为2017051603。

1.2 初筛手段 初筛手段为液相色谱串联质谱检测。采集新生儿足底血，制成干血滤纸片，2～8 ℃冷藏保存，通过专用冷链递送渠道，5 个工作日内送至筛查中心实验室。应用API3200MD 三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX 公司）进行液相色谱串联质谱分析。共定量分析11种氨基酸和31种酰基肉碱，氨基酸包括丙氨酸（ALA）、精氨酸（ARG）、瓜氨酸（CIT）、甘氨酸（GLY）、亮/异亮氨酸（LEU + ILE）、蛋氨酸（MET）、鸟氨酸（ORN）、苯丙氨酸（PHE）、脯氨酸（PRO）、酪氨酸（TYR）、缬氨酸（VAL），酰基肉碱包括游离肉碱（CO）、乙酰基肉碱（C2）、丙酰基肉碱（C3）、丙二酸酰基肉碱（C3DC + C4OH）、丁酰基肉碱（C4）、甲基丙二酰基肉碱（C4DC + C5OH）、异戊酰基肉碱（C5）、甲基巴豆酰基肉碱（C5︰1）、戊二酰基肉碱（C5DC + C6OH）、己酰基肉碱（C6）、己二酰基肉碱（C6DC）、辛酰基肉碱（C8）、辛烯酰基肉碱（C8︰1）、癸酰基肉碱（C10）、癸烯酰基肉碱（C10︰1）、癸二烯酰基肉碱（C10︰2）、十二烷酰基肉碱（C12）、十二烯酰基肉碱（C12︰1）、十四烷酰基肉碱（C14）、十四烯酰基肉碱（C14︰1）、十四二烯酰基肉碱（C14︰2）、3-羟基十四烷酰基肉碱（C14OH）、十六烷酰基肉碱（C16）、十六烯酰基肉碱（C16︰1）、3-羟基十六烷酰基肉碱（C16OH）、3-羟基十六烯酰基肉碱（C16︰10H）、十八烷酰基肉碱（C18）、十八烯酰基肉碱（C18︰1）、十八二烯酰基肉碱（C18︰2）、3-羟基十八烷酰基肉碱（C18OH）、3-羟基十八烯酰基肉碱（C18︰10OH）。参考范围：CIT 5.5～33 μmol/L，MET 11～55 μmol/L、PHE 24～105 μmol/L、TYR 40～330 μmol/L、ARG 1～70 μmol/L。

1.3 复筛手段 复筛手段为液相色谱串联质谱、气相色谱质谱、血甲胎蛋白（AFP）、SLC25A13 基因检测及治疗评估。8 例初筛高度怀疑，通过后续检查确诊；5 例初筛瓜氨酸数值略升高或正常范围高限，但伴有其他氨基酸水平异常，再次进行复筛确诊；3例筛查为阴性，后因黄疸、肝功能异常等住院治疗时再次进行串联质谱分析；14例患儿行基因检测。

1.3.1 液相色谱串联质谱检测 检测方法同“1.2”。

1.3.2 气相色谱质谱检测 采集可疑患儿新鲜尿液制成尿纸片，进行尿气相色谱质谱检测，可检测包括氨基酸、单糖、双糖、嘧啶、嘌呤、核酸、脂肪酸、脂质等在内的132 种小分子代谢物，该检测由第三方检测机构执行，其中需要特别注意的为4-羟基苯丙酮酸（参考范围0～5 μmol/mol）和4-羟基苯乳酸（参考范围0～20 μmol/mol）。

1.3.3 AFP 检测 抽取患儿静脉血2～3 mL，采用迈瑞-2000 化学发光免疫分析系统，以及相应配套的mindray试剂盒检测血中AFP，操作严格按照试剂盒操作说明，正常参考范围1～7 ng/mL。

1.3.4 SLC25A13基因检测 应用乙二酸四乙酸钠（EDTA）抗凝管采集患儿外周静脉血2～3 mL，对于SLC25A13基因采用第二代测序进行检测，同时进行Sanger验证，以及对相关致病基因突变进行分析，对患儿父母基因组DNA相应阳性位点检测，明确该基因突变位点是否来源于父母，或为新发基因突变位点。

1.4 治疗方法 对于有临床表现，高度怀疑肝内胆汁淤积症，常规治疗效果欠佳且易反复的患儿，早期可尝试性给予无乳糖特殊奶粉（蔼儿舒/中链脂肪酸/牛百肽），婴儿期添加辅食时嘱少吃碳水化合物，注意补充维生素A、D、K、E等脂溶性维生素，必要时给予精氨酸、苯甲酸钠等降血氨［1］治疗，根据治疗效果来筛选是否为肝内胆汁淤积症。

2 结果

2.1 初筛结果 初筛出可疑患儿13 例（患儿编号由A～M），蛋氨酸明显升高患儿共8 例（患儿A～患儿H），由于初筛年龄不同，瓜氨酸数值也有所差异，中位数为 263.6 μmol/L，四分位间距为342.39 μmol/L。 患儿A 同时伴有蛋氨酸（99.63 μmol/L）升高，患儿B 与患儿G 的蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸均升高，患儿E 伴有苯丙氨酸（300 μmol/L）、酪氨酸（416 μmol/L）升高，患儿F蛋氨酸（73.97 μmol/L）、苯丙氨酸（133 μmol/L）略升高。其余初筛异常患儿中，患儿I 仅进行四病筛查，表现为苯丙氨酸（354 μmol/L）显著升高，需召回复诊。患儿J～患儿M 中蛋瓜氨酸数值略升高或位于正常范围高限，伴或不伴有其他氨基酸水平的异常，其中瓜氨酸数值依次为34.18 μmol/L（患儿J）、32.82 μmol/L（患儿K）、44.88 μmol/L（患儿L）、41.1 μmol/L（患儿M），而患儿K伴有C14、C16、C16︰1的升高，患儿L 伴有精氨酸（212.7 μmol/L）升高。其他未描述患儿余氨基酸数值均在正常范围内。

2.2 复筛结果

2.2.1 液相色谱串联质谱结果 患儿A 未及时复诊，于28 d 死亡，患儿D 与患儿J 因“黄疸”于外院住院治疗，均未检测。患儿B 瓜氨酸（282.5 μmol/L→420 μmol/L）、精氨酸（85.94 μmol/L→254 μmol/L）较前明显升高，蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸与初筛无明显差异（仍升高）。而患儿G瓜氨酸较前无明显变化，除精氨酸（80.78 μmol/L→132 μmol/L）升高外，蛋氨酸、苯丙氨酸恢复至正常。患儿E 瓜氨酸（244.7 μmol/L→477 μmol/L）升高，精氨酸由正常数值（48.31 μmol/L）升至134.5 μmol/L，苯丙氨酸、酪氨酸与初筛无明显差异（仍升高）。患儿F的蛋氨酸（55.51 μmol/L）较前无明显变化，苯丙氨酸（62.87 μmol/L）降至正常，取而代之的是酪氨酸（282 μmol/L→357.1 μmol/L） 、 精 氨 酸（62.59 μmol/L→165 μmol/L）升高。患儿I 复筛时进行串联质谱检测时显示瓜氨酸（596 μmol/L）、蛋氨酸（121 μmol/L）、苯丙氨酸（155.2 μmol/L）、精氨酸（140 μmol/L）均升高。 患儿C 精氨酸（38.96 μmol/L→139 μmol/L）较初筛值升高。患儿H 复筛除瓜氨酸（99.61 μmol/L→265 μmol/L）较前升高外，余氨基酸水平无明显改变。患儿K、患儿L、患儿M 的瓜氨酸（依次为333 μmol/L、496 μmol/L、497 μmol/L）均显著升高，患儿K 复筛时C14、C16、C16︰1 恢复正常，而精氨酸（475 μmol/L）升高。患儿L 精氨酸较前变化不大，患儿M 酪氨酸（123.66 μmol/L→354.1 μmol/L） 、精 氨 酸（20.19 μmol/L→141 μmol/L）升高。患儿N、患儿O、患儿P 串联质谱结果各项指标均未见异常（为漏筛病例），未进行复筛，后期因“皮肤黏膜黄染并进行性加重”住院治疗时，复筛串联质谱等检查，瓜氨酸均显著升高，依次为541 μmol/L、267 μmol/L、150 μmol/L，患儿N 伴有蛋氨酸（95.85 μmol/L）升高，患儿O 伴有蛋氨酸（74.79 μmol/L）、精氨酸（71.56 μmol/L）略升高，患儿P余氨基酸水平正常。

2.2.2 气相色谱质谱结果 除患儿A、患儿D、患儿J 未检测，余患儿（包括患儿N、患儿O、患儿P）4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乳酸均显著升高。4-羟基苯丙酮酸中位数为82.3 μmol/mol，四分位间距为342.39 μmol/L；4-羟基苯乳酸位数为645.1 μmol/mol，四分位间距为733.6 μmol/L。

2.2.3 血AFP 结果 除患儿A、患儿D、患儿J 未检测，其他患儿（包括患儿N、患儿O、患儿P）AFP 数值均明显升高，其中患儿B、患儿C、患儿E、患儿H、患儿I、患儿K 数值均超过测量范围最高限（>80 000 ng/mL），余患儿中位数为47 882.5 ng/mL，四分位间距为5 8320 ng/mL。

2.2.4 SLC25A13 基因结果 除患儿A 和患儿B，其他患儿（共14 例）均进行基因检测，患儿F 为等位基因纯和突变（突变位点c.852_855del，父母各携带一个），患儿L、患儿M、患儿O 只检测出一个突变位点（但根据串联质谱、尿有机酸分析、甲胎蛋白、肝肾功能、临床表现以及治疗效果评估均可临床确诊），患儿O 提示突变来源于母亲，患儿L 与患儿M 在父母基因中均未检测到。余患（共10例）为杂合突变，且突变均来自于父母，无新发突变。共有11 个突变位点，其中错义突变1 个：c. 1475G>A，移码突变1个：c.1638_1660dup，插入突变1 个：IVS16ins3kb，整码突变1 个：c. 852_855del，剪切位点突变3 个：c.615 + 5G>A、c.1177 + 1G>A、c.755-1G>C，无义突变3 个：c.742G>A、C.1078C>T、c.955C>T、c.889G>T。最常见的突变位点为c. 852_855del，占50%，第二常见突变位点为IVS16ins3kb，占33%。

2.3 治疗结果评估 患儿治疗后除患儿L失访、患儿A死亡外，余患儿均定期监测患儿体格发育、营养状况，每1～3月检测串联质谱、尿有机酸分析、甲胎蛋白、肝肾功能、血脂、血糖；每3～6月采用Gessell儿童发育量表测定发育商（DQ），各项异常指标均较前明显下降，并逐渐恢复正常，皮肤黏膜黄染明显好转。

3 讨论

各地区新生儿筛查确诊肝内胆汁淤积症有所差异。浙江省186 万新生儿筛查中，筛查确诊29例，检出率为1/68 935，漏筛2例，患病率为1/64 138［8］。湖南省565 182 例新生儿筛查中，筛查确诊6 例，检出率（即患病率）为1/94 197［9］。广州市124 250 例新生儿筛查对象中，筛查确诊1 例，检岀率为1/124 250，发现3 例假阴性，患病率1/31 062［10］。徐州地区共筛查新生儿461 494 例，最终明确13 例，检出率（即患病率）1/36 038。LIN 等［6］的研究显示，人群中肝内胆汁淤积症的患病率为1/26 403。本研究中，菏泽地区共筛查296 106 例新生儿，肝内胆汁淤积症患儿16例，筛查确诊13例，检出率1/22 777，假阴性3 例，患病率1/18 506，明显高于其他省市发病率，虽与LIN 等的研究相近，但也存在差异，这是否与样本量少、统计年限短以及生活条件等因素相关，有待进一步研究论证。

肝内胆汁淤积症是由SLC25A13 基因的双等位基因突变引起的一种疾病，在东亚人群中相对常见。SLC25A13 基因位于染色体7q21.3，由18 个外显子组成，转录翻译成一种具有二聚体结构位于线粒体内膜的钙结合性跨膜天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白（希特林蛋白），共有675个氨基酸［11］，主要参与苹果酸—天冬氨酸的穿梭过程中谷氨酸—天冬氨酸转运，同时向线粒体内提供一个质子H +［12］。当基因突变导致希特林蛋白功能障碍时，天冬氨酸无法从线粒体转运至胞质，胞质中天冬氨酸不足，抑制精氨酸代琥珀酸合成酶，从而引起尿素循环障碍、蛋白质合成受阻、肝细胞脂肪变性，导致血中瓜氨酸升高。同时机体可能通过其他氨基酸代偿进一步弥补尿素循环功能及能量代谢障碍，使其他氨基酸出现相应的改变［13］，如蛋氨酸、苯丙氨酸等。本研究中患儿的串联质谱分析结果与之相对应。本研究中SLC25A13 基因最常见的突变位点为c.852_855del，与陕西地区研究显示最常见位点［14］相似。而另有研究［15］显示，此突变位点在南方地区更常见且明显多于北方地区。这种差异可能与数据偏倚以及样本量较少有关。第二常见突变位点为IVS16ins3kb，这与CHEN 等的研究相呼应［16］。 但少数患儿的SLC25A13 基因仅发现1 个突变位点，这可能与该地区经济条件所限，大部分患儿仅进行SLC25A13 基因靶向测序，使位于内含子、调控区的基因突变不易检出有关。而少数进行全基因组外显子检测的患儿，当基因存在大片碱基插入或碱基缺失突变时，传统的基因检测手段无法检测，需结合cDNA 克隆或进行功能分析［17］，这使检测难度进一步增加。虽然基因检测未能明确诊断，但是根据临床表现、生化结果以及给予无乳糖奶粉治疗后效果显著均提示为肝内胆汁淤积症。

值得注意的是，本文报道的患儿K 及患儿I，患儿K（3日龄时）初筛结果示瓜氨酸在正常范围高值，但C14、C16以及C16︰1明显升高，遂召回复筛，患儿复筛时为31日龄，查体示精神差，刺激反应欠佳，皮肤黄染至腹部，肝脏未触及明显肿大，复筛结果示瓜氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸均显著升高，同时查肝功未见明显异常，腹部超声仅表现为胆囊内略强回声。部分研究显示随着时间的推移，肝内胆汁淤积症患儿的长链酰基肉碱（包括C14、C16）可成逐步上升趋势［18］，这可能与线粒体中脂肪酸的β-氧化（FAO）受到抑制相关［19］，肉碱作为长链脂肪酸的唯一载体，当长链酰基肉碱水平升高时，长链脂肪酸也相应增多，长链脂肪酸以甘油三酯的形式储存在脂肪组织中。该患儿SLC25A13 基因为复合杂合突变（c.615 + 5G>A/c.742G>A），王彩虹等曾报道1例携带有c.615 + 5G>A 的复杂杂合突变的患儿，也伴有甘油三酯的升高，但同一报道中携带相同突变的另一患儿并未升高［20］，另一突变位点c. 742G>A 使位于第248 位的酸性氨基酸谷氨酸突变为碱性氨基酸赖氨酸，其临床意义未明确，有待进一步的研究分析基因型与表型是否相关。而患儿I 仅进行四病筛查，筛查时提示苯丙氨酸升高，遂召回复筛串联并完善相关检查后确诊，再次提醒临床儿科医师，单纯苯丙氨酸升高时，除排除常见的高苯丙氨酸血症以外，也要注意与肝内胆汁淤积症鉴别以防漏诊。

因肝内胆汁淤积症患儿早期（3～7 日龄时）不伴有临床症状时，瓜氨酸升高可不显著，这导致仅基于串联质谱的新生儿筛查技术准确诊断肝内胆汁淤积症具有挑战性，当肝内胆汁淤积症患儿表现出典型的胆汁淤积时，血氨基酸谱也发生改变，以瓜氨酸升高为主要特点，可伴有蛋氨酸、鸟氨酸、酪氨酸等明显升高［6，11］。但延期进行足底血筛查的风险更大，是否具有可行性有待于更进一步。虽有研究显示，iPLEX 检测可显著提高新生儿肝内胆汁淤积症的筛查阳性率，但基于经济等问题未应用于临床。研究发现，与新生儿筛查确诊及时治疗的患儿相比，在新生儿筛查中被漏诊，后期发病确诊的患儿，临床症状更重、更急。这对于儿科医师而言，早期确诊显得尤为重要，即使患儿初次串联质谱结果正常，当出现临床症状（如常规治疗后皮肤黏膜黄染进行性加重、肝脾肿大、肝功能异常等），应再次复筛串联质谱检测，必要时结合气相色谱质谱、血AFP 以及基因检测，以尽早确诊，提高诊出率，降低假阴性的发生率。

总之，串联质谱技术是筛查肝内胆汁淤积症最常用检测手段之一，部分早期瓜氨酸值改变不明显患儿，伴或不伴有其他氨基酸（如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸）异常，复筛时联合尿气相色谱、血AFP、SLC25A13 基因检测等可提高检出率，基因检测作为诊断肝内胆汁淤积症的金标准仍有局限性，即使未检测出突变位点，根据化验检测、临床表现以及治疗有效可临床确诊。需要特别注意的是，少部分患儿即使初次串联质谱结果正常，当出现临床症状（如常规治疗后皮肤黏膜黄染进行性加重、肝脾肿大、肝功能异常等）时，应即使给予复筛串联质谱检测，以早期提高诊出率。