胚胎停育患者绒毛组织染色体检测分析

李肖华，石子佳，王俊霞，程青青，郑宗朋，高健

1 河北省人民医院生殖遗传科，石家庄 050051；2 邯郸市第一医院胎儿医学科

胚胎停育是指胚胎或胎儿在没有外界干预的情况下死亡后滞留宫腔，在自然流产中的发生率为2.6%～9.4%，但仍有高达50%的病例未发现病因［1］。多种因素导致胚胎停育，但最为常见的原因为染色体异常［2］。研究［3］显示，针对胚胎停育的病因进行分析可为医疗管理、生殖咨询和促进患者康复提供重要信息。基因组拷贝数变异测序（CNV-seq）是一种低深度的全基因组测序，可一次性分析23对染色体非整倍体以及大于100 kb的染色体拷贝数变异，目的是用来筛选符合患者临床的染色体变异，具有准确性及全覆盖性特点，正在越来越多地应用于胎儿筛查、自然流产和临床未确诊的疾病中。本研究采用CNV-seq检测胚胎停育患者的流产绒毛组织中的染色体，并分析其染色体异常情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年9月—2020年12月河北省人民医院收治的胚胎停育患者240 例，年龄26～49 岁，停经时间42～84 d；育龄者（预产期年龄≤35 岁）208 例，高龄者（预产期年龄>35 岁）32 例；胚胎停育1 次136 例、2 次51 例、3 次33 例、4 次15 例、≥5 次5 例。纳入标准：①超过6 周仍无妊娠囊；②妊娠囊≥4 cm，却无胎芽；③出现胎芽，但未见胎心搏动；④临床资料完整。排除标准：①夫妇双方中有任意一方有家族遗传病史；②患者有免疫系统疾病：如血栓性疾病、系统性红斑狼疮等；③患者有慢性内科病史：如高血压、心脏病、糖尿病、甲状腺疾病等；④患者子宫发育畸形；⑤患者吸烟史。本研究程序符合河北省人民医院伦理准则。所有患者在知情同意的原则下，自愿选择流产组织基因组拷贝数变异测序检测并同意参与本研究，且均已签署知情同意书。

1.2 流产绒毛组织染色体检测方法 采用CNV-seq检测。所有患者均行清宫术，术后选取新鲜、颜色透亮的绒毛组织5～10 g，用0.9%氯化钠溶液冲洗，冷冻保存，送至北京博奥医学研究所进行检验，采用北京博奥医学研究所配套检测试剂盒及优化标准操作，具体过程：使用18个高度多态性短串联重复序列标记（STR），包括21号染色体的5个标记（D21S1435、D21S11、D21S1437、D21S1411、D21S2039），18 号染色体的4 个标记（D18S978、D18S391、D18S535 和D18S386），13 号染色体的4 个标记（D13S628、D13S742、D13S634 和 D13S305），以及性染色体的5个标记（DXS7423、DXYS267、TAF9、AMEL、SRY）。利用荧光标记多重PCR 技术针对以上STR 位点进行多重PCR 扩增。扩增产物经ABI 3500 xL 测序仪毛细管电泳检测出各基因座的等位基因电泳数据，将电泳数据导入分析软件ABI Gene Marker V2.2.0，进行数据分析及结果判断。同时取孕妇外周血2～3 mL，行短串联重复序列检测，以排除母源性污染因素对绒毛染色体的影响。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

240 例份胚胎停育患者流产绒毛组织中，染色体异常181 例份（75.42%）、染色体正常59 例份（24.58%）。181 例份染色体异常绒毛组织中，染色体数目异常97 例份，其中常染色体三体76 例份、性染色体单体18例份、三倍体3 例份；结构异常120例份；部分标本同时出现染色体数目异常和结构异常。76 例份常染色体三体中，2-三体6 例份、4-三体3例份、7-三体2例份、8-三体4例份、12-三体1例份、13-三体3 例份、14-三体5 例份、15-三体4 例份、16-三体24 例份、17-三体2 例份、18-三体1 例份、20-三体3 例份、21-三体7 例份、22-三体11 例份；18 例份性染色体单体中，均为X单体。

育龄胚胎停育患者和高龄胚胎停育患者流产绒毛组织中染色体异常分别为157 例份（75.48%）、24例份（75.00%）。育龄者常染色体三体61 例份、性染色体单体16 例份、三倍体3 例份，高龄者分别为15、2、0 例份，两者常染色体三体例份数比较，P<0.05。

胚胎停育1次、2次、3次、4次、≥5次患者流产绒毛组织染色体异常例份数分别为100、46、22、9、4 例份，胚胎停育2 次者分别与胚胎停育3 次、4 次者比较，P均<0.05。胚胎停育1 次、2 次、3 次、4 次、≥5 次患者流产绒毛组织染色体数目异常例份数分别为58、26、11、2、0 例份，胚胎停育1 次者、2 次者分别与胚胎停育4 次者比较，P均<0.05。CNV 一共检测出120 例份，7 号染色体发生频次较高，大小在104.17～133.84 Mb；其中18 例份为致病性，发生频次较高的染色体依次为7、4、8号染色体；2例份为可能致病，发生在6、7号染色体；87例份为临床意义未明，发生频次较高的为7、16、17 号染色体；13 例份（13/240，5.42%）为可能良性，发生频次较高的为1、4、10、7 号染色体。其中69 例份同时出现两个或两个以上位点的CNV。120例份中有32例份具有两个或更多致病性不同的CNV，此时以致病性最强的作为评价。按片段长度来分析，18 例份致病性变异中，CNV 大小为0.135～133.7 Mb；2 例份可能致病变异的病例中CNV分别为0.207、0.616 Mb；87例份临床意义未明病例中，CNV大小为104.17 kb～5.8 Mb；13 例份可能良性病例中，CNV 大小在105.82～659.30 kb。

3 讨论

胚胎停育是临床流产常见的一种，妊娠结局通常为自然流产或稽留流产，导致胚胎停育的原因包括遗传因素、内分泌异常、免疫因素、宫内感染等原因，染色体异常是最常见原因［1］。对流产组织进行细胞遗传学研究，不仅能够为生育困难患者提供遗传指导，还有助于推动流产病理学的临床研究［2］。本研究240 例样本中染色体异常总检出率为75.42%，而其他相关文献报道的胚胎停育染色体异常率在38.6%～60%［2，4-7］，说明约大半的胚胎停育病例可以在遗传方面找到病因，根据具体的染色体异常将得到有效的生育指导。

染色体异常中数目异常最常见的是常染色体三体［2，8］，本研究与之一致。文献［2］报道，所有染色体中仅1 号染色体未发现三体，常染色体中发生率最高的是16-三体，其次为22-三体、21-三体、15-三体［2，7-10］，本研究中的发生率与之一致。染色体结构异常包括染色体的易位、倒位及片段的缺失、重复等，绒毛组织检测发现染色体结构异常约为44.44%［11］，明确致病性的结构异常检出率为3.95%～7.14%［3，12-13］，而本研究的检出率分别为50%、7.5%。相对来说，7 号染色体发生微重复微缺失的频率较高，可能是由于7 号染色体进化不稳定性相对较高，在发育过程中造成了更多的微重复微缺失，但其致病性还需进一步求证［14］。人类基因组的变异存在多种形式，正是这些变异使人类不断进化，在物种进化和遗传多样性方面具有生物学重要性［15］，所以出现CNV 并不一定致病。因此CNV-seq对报告的解读分为致病、可能致病、临床意义不明、可能良性和良性［16］。这种结果及其影响的不确定性使临床医生和患者陷入了两难境地，相信随着科学技术的发展能够证实这些CNV 的临床意义［17-18］。在临床工作中可对其父母双方进行CNV 检测，以确定变异来源于父母遗传还是新发变异，对指导再次妊娠及产前诊断具有重要的意义。自然流产中最常见的三体类型与孕妇年龄密切相关［19］。卵裂期胚胎中非整倍性随母体年龄增加而增加的发现已广为人知［3］。SOLER 等［20］分析了染色体异常和年龄之间的相关性，发现由低龄组到高龄组，染色体异常率由61.3%升高到76.8%。ZHANG 等［21］发现，与致病相关的染色体异常的发生率呈年龄依赖性增加。研究［22］发现，Turner 综合征的发病率随着年龄的增长而降低，在本研究中同样如此，同时发现高龄者常染色体三体率明显高于育龄者，而染色体结构异常在两组未见有统计学差异，即未发现随着孕妇年龄增加染色体结构异常有增高的趋势，这对染色体病发生机制研究和临床咨询都有深远意义。有研究表明，单次胚胎停育的染色染异常率高于多次出现的胚胎停育［2，23］，因为染色体出现异常为偶然因素，连续多次出现的可能性不大。但也有文献报道，单次和多次胚胎停育者染色体异常差异没有统计学意义［24-25］。

总之，胚胎停育患者流产绒毛组织染色体异常率较高，异常类型为染色体数目异常或结构异常，常染色体多数以三体发生常见，其中16-三体发生率最高，其次为22-三体、15-三体、21-三体等；性染色体异常以X单体为常见。育龄和高龄胚胎停育患者流产绒毛组织染色体异常无差异，但不同胚胎停育次数患者流产绒毛组织染色体异常存在差异。