牛结核病诊断技术研究进展

文│陈亮（四川省三台县动物疫病预防控制中心）

牛结核病被世界动物卫生组织列为法定报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。该病可以在人类和家畜或者野生动物之间传播，危害巨大，有学者指出，“牛结核病是对农业生产最具破坏力的传染病之一”。牛奶及其制品是人类经常饮用（食用）的食品，其受到污染也会导致人类感染。由于误食受污染的乳制品而感染肺结核的患者占总患者的10%以上。由于抗生素滥用、牲畜调运增多等因素，牛结核病的发生率显著提升，严重影响了养牛业的健康发展，公共卫生安全也受到威胁。由于牛结核病还没有有效的疫苗，多数国家通过监测，将检测出的阳性个体进行扑杀来防控牛结核病。为了更好地预防和控制牛结核病，笔者对牛结核病的病原学特性、流行病学特点和诊断技术等进行综述，希望为控制和消灭牛结核病提供部分理论支撑。

一、病原学特性

牛结核病的病原为分枝杆菌属的牛分枝杆菌。牛分枝杆菌为革兰氏阳性菌，为专性需氧菌，长1.5～4微米，宽0.2～0.5微米，无鞭毛，无运动性，不形成芽孢。体外培养牛分枝杆菌时，温度需设定为37.5℃，pH＝5.9～6.9，在此条件下，该菌可较好生长，但生长速度较慢。牛分枝杆菌对外界环境的抵抗力很强，在阴湿处可存活5个月以上，干燥环境下可存活10个月，在水中可存活半年，在粪便和土壤中可以存活6～7个月。但分枝杆菌在高温下不易存活，阳光暴晒2小时，60℃下10～30分钟，85℃下5分钟，90℃下1分钟都可以杀死该菌。

二、流行病学

病畜和带菌畜是牛结核病的主要传染源，病畜和带菌畜的分泌物和排泄物中均带菌。牛分枝杆菌可以通过呼吸道、消化道和皮肤黏膜传播。结核病病牛咳嗽时，会将带有牛分枝杆菌的飞沫排放到空气中，牛或者其他动物吸入带菌的飞沫就会感染结核病。食用被结核菌污染的食物或未经消毒的乳产品也会感染结核病。牛分枝杆菌易感染牛尤其是奶牛，其次是人、禽类和野生动物等。该病无明显的季节性，一年四季均可发生，在农村散发，规模化养殖场因圈舍通风差，互相接触多，多呈区域性流行。

三、诊断方法

1.细菌学方法。

（1）涂片染色法。采集典型病变组织（如肺、肝）样进行涂片，并使用萋尼二氏抗酸染色法染色，在显微镜下观察，可以发现，分枝杆菌会被染成红色，而其他细菌会被染成蓝色。涂片染色法操作简便、设备简单，是使用较普遍的方法。但此方法无法鉴别出分枝杆菌和非典型分枝杆菌，缺乏特异性，而且实验的精准性不高，只适合检测病菌数量多的组织样品。因此，涂片染色法一般用于初步诊断，如需确诊还需要结合其他的诊断技术。

（2）细菌培养法。培养法是诊断牛结核病的标准方法。采集病牛鼻腔中的分泌物进行细菌分离培养，根据菌落的形态结构判定是分枝杆菌还是其他细菌。此法对病菌含量较低的组织样也可以检测出，且灵敏度高。但由于结核菌生长周期长，一般为4～8周，而且培养成功率仅占发病病例的10%～20%。为了避免污染物带来的影响，可以使用高效液相色谱去污法控制样品中污染物的生长，这样可以缩短样品处理的时间，缩短牛分枝杆菌的分离时长，从而帮助菌落的早期生长。

（3）噬菌体生物扩增法。分枝杆菌噬菌体具有特定的宿主菌谱，且只能感染活的分枝杆菌。分枝杆菌噬菌体感染宿主后，可以在把宿主菌完全裂解前持续增殖，子代的噬菌体就会随着菌体的裂解而释放，与相应的指示细胞结合后又通过裂解指示细胞释放，最后在琼脂平板上呈现出透明的噬菌斑。根据琼脂平板上是否有噬菌斑就可以判断样品中是否含有活的分枝杆菌。该方法在国外已商品化应用，我们近些年才开始重视和使用。

2.分子生物学诊断技术。

（1）聚合酶链式反应。聚合酶链式反应（PCR技术）是将特定的DNA片段或cDNA片段在体外特定条件下短时间内大量扩增目的片段，其灵敏性、特异性和检测速度都得到认可。目前，常用的包括逆转录PCR法、套氏PCR法、单管套式逆转录PCR法、实时荧光PCR法、酶联PCR法等。PCR技术灵敏度高，检测速度快，还可以有效避免其他非结核分枝杆菌的干扰，但由于此检测方法需要专业的检测人员和专业的检测设备，所以多在检测机构使用。

（2）DNA核酸探针检测法。将特异性的DNA片段使用特殊的示踪剂进行标记作为探针，在特定条件下与待检样品DNA分子上的遗传片段进行互补杂交。这样就可以确定结核分枝杆菌的种类。目前比较常用的有cDNA探针、全染色体核酸探针、寡聚核酸探针和克隆核酸探针等。

（3）全基因组测序。全基因组测序技术是将待测样品的基因进行高通量测序，从而得到全基因组序列，再使用生物信息学技术进行分析，从基因组学层面进行调查。全基因组测序技术可以结合数学模型，鉴别和分析同一地区不同物种间的毒株型，进而了解跨物种的动态传播方式。此方法全面、精准，而且快捷高效，但成本和技术要求较高，只适用于实验室检测。

3.免疫学诊断技术。

（1）皮内变态反应试验。ESAT-6和CFP-10是结核菌素早期分泌的抗原，是做皮试反应的首选抗原。将分离纯化的抗原注射到牛颈中部或者尾褶部皮肤皮内，观察比较注射前和注射后72小时的皮肤肿胀情况，从而判断是否患牛结核病。此方法的缺陷是特异性低，无法区分出因感染其他分枝杆菌而致敏的动物，而且对那些因病情严重而免疫力低下的动物也容易出现假阴性。那些感染了副结核分枝杆菌等环境分枝杆菌的动物也有可能出现假阳性。提纯结核菌素的质量和剂量，检测人员的操作经验和结果判定标准等均会影响结果。为了消除禽分枝杆菌的干扰，现在使用较多的是比较皮内变态反应。在牛颈部一侧相隔大于12厘米的位置分别注射牛结核菌素和禽结核菌素，注射量超过2000国际单位/头，注射完成后观察到豌豆状的鼓包，即代表皮内注射成功。

（2）酶联免疫吸附试验。牛感染牛分枝杆菌后，B淋巴细胞会产生对应的免疫应答，产生与疾病发展态势呈正相关的抗体。该实验原理是利用具有特异性的抗原（如融合蛋白）作为酶联免疫吸附试验的诊断抗原，检测血清内是否含有结核菌抗体。该方法操作便捷、快速、灵敏度高。缺点是牛分枝杆菌的抗原性较弱，假阳性出现概率大。

（3）γ-干扰素诊断法。利用牛结核刺激抗原，如提纯结核菌素，与体外培养出的致敏淋巴细胞结合，致敏淋巴细胞会分泌出大量的γ-干扰素，然后通过酶联免疫吸附试验来检测γ-干扰素的表达水平，从而得到判定结果。健康牛的淋巴细胞不会以特定的方式产生γ-干扰素，所以该法可以降低检测假阳性和假阴性的发生率。此法与皮内变态反应结合使用，检测准确度较高，而且由于在体外进行，不会干扰牛本身的免疫情况，同一头牛可进行多次试验。但此方法成本较高，不适合基层大范围使用。

四、结语

牛结核病的防控对促进畜牧业健康发展，保障人类健康具有重要意义。临床上可以使用细菌学、分子生物学和免疫学方法对结核病进行诊断，但由于分子生物学技术需要专业仪器，且技术要求高，血清学技术所需试剂，价格昂贵。目前，较普遍的诊断方式是先通过结核菌素皮内变态反应进行初步判定，对疑似病例再使用分子生物学技术进一步确诊。