苦瓜中葫芦烷型三萜成分及其抗肝纤维化活性的研究

岳佳音,徐 静,张晓书,赵余庆

1.沈阳医学院药学院，沈阳 110034；2.沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院，沈阳 110016

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是各种急、慢性肝病共同的病理基础，主要特征为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增多、降解不足且过度沉积［1］。肝纤维化进一步发展会演变为肝硬化甚至肝癌［2-3］，将严重影响患者的生活质量。在肝损伤期间，静止的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）表型转化成激活型并增殖，活化的HSC 是ECM 的主要来源细胞，因此抑制活化的HSC 增殖是治疗肝纤维化的有效途径。

苦瓜（Momordica charantiaL. ）系葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属植物苦瓜的未成熟果实［4］，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，在许多国家和地区均有入药记载。现代药理学研究表明，苦瓜具有降血糖、降脂、抗肿瘤、抗病毒等作用［5-7］。自20 世纪60年代起，国内外学者开始对苦瓜的化学成分进行研究，随着分离手段和波谱技术的不断进步，目前分离得到的成分主要有酚类、黄酮类、三萜类、蛋白质及多糖等［8］，其中葫芦烷型三萜化合物被认为是苦瓜中主要的活性成分，有抗肿瘤、降血糖、抗炎等多种生物活性［9-12］。本课题组前期研究发现，苦瓜中的葫芦烷型三萜类成分能较好地抑制活化HSC 的增殖［13］。酸水解处理苦瓜乙醇提取物不但能富集一种或几种活性好的苷元，还可能发现更多活性好的新苷元［14］。为进一步从苦瓜中获得更好的活性成分，本实验对苦瓜乙醇提取物酸水解后的化学成分进行系统研究，从中分离并鉴定出10 个葫芦烷型三萜化合物（结构见图1），并用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl tetrazolium， MTT）法对化合物1～7 进行大鼠活化的肝星状细胞t-HSC/Cl-6 的抑制增殖活性进行测定，其中化合物1 和化合物2具有一定抑制t-HSC/Cl-6 增殖的作用。

图1 化合物1～10 的结构Fig.1 Structures of compounds 1—10

1 仪器与试药

1.1 仪器

Bruker ARX-400 型核磁共振波谱仪、Bruker-IFS-55 红外光谱仪、Bruker MicrOTOF-Q 高分辨电喷雾质谱仪均购自德国Bruker 公司；MOS 450 AF/CD 旋光测定仪（法国BioLogic 公司）；LC3000 型半制备高效液相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司）；UV2800AH 型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；酶标仪（美国 Bio-Rad 公司）；柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；薄层硅胶GF254（青岛海洋化工有限公司）；半制备色谱柱：YMCODS-A（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）；Sephedex HL-20 葡聚糖凝胶（瑞典GE-healthcare bio-sciences AB 公司）；MCI gel（75～150 μm，日本Mitsubishi 公司）。

1.2 试药

氘代氯仿、氘代吡啶均购自北京市汉威士波谱公司；色谱级甲醇、乙腈均购自天津康科德科技有限公司；其余常规试剂均为分析纯。DMEM 细胞培养基（HyClone 公司）；水飞蓟素（silymarin，质量分数为98%、MTT、二甲基亚砜均购自美国Sigma 公司；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；大鼠肝纤维化细胞t-HSC/Cl-6 株（中国科学院细胞库）。苦瓜干燥饮片于2013年购自广西柳州，由沈阳药科大学中药学院路金才教授鉴定为葫芦科植物苦瓜Momordica charantiaL. 的干燥未成熟果实。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取苦瓜干燥未成熟果实饮片10 kg，用80 L 体积分数为70%的乙醇加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液浓缩至干，用水分散后，静置冷却，得到不溶于水的浸膏220 g。称取浸膏100 g，用3 倍量甲醇溶解，得样品溶液，加入100 mL 盐酸水解，超声30 min，静置3 d，加大量水稀释，离心，取沉淀于50 ℃干燥，称定质量，得水解产物48 g。

将盐酸水解产物（48 g）用硅胶柱进行层析分离，湿法装入480 g 300～400 目硅胶，干法上样，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（50∶1、25∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1）。经薄层色谱法检识，用体积分数为5%的香草醛溶液显色，合并相同主斑点后得到6 个主要流份（Fr.A～Fr.F）。Fr.A 以石油醚为溶剂多次重结晶后，用半制备高效液相色谱纯化（体积分数为89%的甲醇），得到化合物3（50.1 mg）。Fr.B 经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（100∶1、50∶1、20∶1）梯度洗脱，得到7 个流份（Fr.B1～Fr.B7）。 Fr.B4 经Sephadex LH-20 凝胶柱层析（体积分数为100%的甲醇） 洗脱，再用反相半制备HPLC 纯化（体积分数为83%的甲醇），得到化合物1（5.4 mg）和化合物2（4.6 mg）。Fr.C 经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮（100∶1、50∶1、20∶1、3∶1）梯度洗脱，得到8 个流份（Fr.C1～Fr.C8）。Fr.C5 经Sephadex LH-20 凝胶柱层析（体积分数为100%的甲醇）洗脱，再用HPLC 半制备高效液相色谱纯化（体积分数为89%的甲醇），得到化合物4（9.0 mg）、化合物6（15.0 mg）、化合物10（6.5 mg）。Fr.D 以石油醚-乙酸乙酯（10∶1）等度洗脱，得到5 个流份（Fr.D1～Fr.D5）。Fr.D3 经反相半制备HPLC 纯化（体积分数为89%的甲醇），得到化合物7（11.3 mg）。Fr.F 经MCI 柱色谱进一步分离，以甲醇-水为流动相梯度洗脱（30∶70、50∶50、70∶30、90∶10、100∶0），得到5 个流份（Fr.F1～Fr.F5）。Fr.F3经过反相半制备HPLC 纯化（体积分数为89%的甲醇），分别得到化合物5（9.3 mg）、化合物8（23.8 mg）和化合物9（6.8 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物3：白色无定形粉末。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δH：6.03（1H，dd，J= 9.7，1.9 Hz，H-6），5.63（1H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-7），5.50（1H，m，H-23），δ5.39（1H，d，J=15.8 Hz，H-24），3.66（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19A），3.50（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19B），3.14（3H，s，25-OCH3），1.24（6H，s，CH3-26，CH3-27），1.19（3H，s，CH3-29），0.90（3H，s，CH3-21），0.88（3H，s，CH3-28），0.86（3H，s，CH3-30），0.85（3H，s，CH3-18）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：17.7（C-1），27.5（C-2），76.3（C-3），37.3（C-4），87.6（C-5），131.9（C-6），131.6（C-7），52.1（C-8），45.4（C-9），39.0（C-10），23.7（C-11），30.9（C-12），45.6（C-13），48.7（C-14），33.3（C-15），28.1（C-16），50.4（C-17），15.1（C-18），80.0（C-19），36.2（C-20），18.8（C-21），39.5（C-22），128.5（C-23），137.0（C-24），75.0（C-25），25.9（C-26），26.3（C-27），20.7（C-28），24.7（C-29），20.2（C-30），50.1（25-OCH3）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为5β，19-epoxy-25-methoxycucurbita-6，23（E）-dien-3β-ol［17］。

化合物4：白色无定形粉末。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δH：5.83（1H，dd，J= 4.9 Hz，H-6），5.50（1H，m，H-23），5.38（1H，d，J=15.8 Hz，H-24），3.34（3H，s，7-OCH3），3.14（3H，s，25-OCH3），1.24（6H，s，CH3-26，CH3-27），0.89（3H，d，6.1 Hz，CH3-21），1.20，1.03，0.98，0.92，0.69（各3H，s，CH329，28，19，18，30-）。13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δC：21.2（C-1），28.7（C-2），76.9（C-3），41.9（C-4），146.9（C-5），121（C-6），77.3（C-7），48.1（C-8），34.1（C-9），38.8（C-10），32.7（C-11），30.2（C-12），46.2（C-13），48.0（C-14），34.8（C-15），27.7（C-16），50.1（C-17），15.6（C-18），28.9（C-19），36.3（C-20），18.9（C-21），39.6（C-2），128.6（C-23），136.9（C-24），75.0（C-25），26.2（C-26），25.9（C-27），27.9（C-28），25.5（C-29），18.1（C-30），56.4（7-OCH3），50.4（25-OCH3）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为karavilagenin A［18］。

化合物5：白色无定形粉末。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δH：6.11（1H，d，J= 15.8 Hz，H-24），6.03（2H，dd，J= 9.7，1.6 Hz，H-6），5.58（1H，m，H-23），5.63（2H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-5），4.85（2H，s，H-26），3.66（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19B），3.51（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19A），1.19（3H，s，CH3-28），0.89（6H，s，CH3-29，CH3-30），0.88（3H，s，CH3-18），0.86（3H，s，CH3-27）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：17.6（C-1），27.4（C-2），76.2（C-3），37.2（C-4），87.5（C-5），131.8（C-6），131.5（C-7），52.0（C-8），45.3（C-9），38.8（C-10），23.6（C-11），30.8（C-12），45.5（C-13），48.6（C-14），33.2（C-15），28.1（C-16），50.3（C-17），14.9（C-18），79.9（C-19），36.6（C-20），18.7（C-21），39.8（C-22），129.2（C-23），134.2（C-24），142.2（C-25），114.2（C-26），18.7（C-27），20.5（C-28），24.6（C-29），20.1（C-30）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为（23E）-5β，19-epoxycucurbita-6，23，25-triene-3β-ol［19］。

化合物6：白色无定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.14（1H，dd，J= 9.7，2.0 Hz，H-6），5.97（2H，m，H-23，H-24），5.62（1H，dd，J= 9.7，2.9 Hz，H-7），1.56（3H，s，H-27），1.56（3H，s，H-26），1.39（3H，s，H-28），0.97（3H，d，J= 5.9 Hz，H-21），0.90（3H，s，H-29），0.82（3H，s，H-18），0.77（3H，s，H-30）。13CNMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：18.4（C-1），28.4（C-2），76.6（C-3），38.0（C-4），88.0（C-5），132.8（C-6），131.8（C-7），52.5（C-8），45.8（C-9），39.6（C-10），24.2（C-11），31.3（C-12），46.0（C-13），49.1（C-14），33.7（C-15），28.5（C-16），50.5（C-17），15.4（C-18），80.2（C-19），36.9（C-20），19.2（C-21），39.9（C-22），124.6（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.3（C-26），31.4（C-27），25.0（C-28），21.4（C-29），20.6（C-30）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为23E-5β，19-epoxy-cucurbita-6，23-dien-3β，25-diol［20］。

化合物7：白色无定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.40（1H，dd，J=9.7，2.1 Hz，H-6），5.69（1H，dd，J= 9.7，3.3 Hz，H-7），5.62（1H，m，H-23），5.58（1H，br. s，H-24），3.23（3H，s，25-OCH3），1.49（3H，s，H-29），1.34（3H，s，H-26），1.34（3H，s，H-27），0.96（3H，d，J= 4.0 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-28），0.87（3H，s，H-30），0.83（3H，s，H-18）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：19.5（C-1），28.0（C-2），75.2（C-3），38.1（C-4），85.1（C-5），133.5（C-6），133.0（C-7），45.3（C-8），51.4（C-9），41.1（C-10），22.4（C-11），30.5（C-12），45.7（C-13），48.7（C-14），33.8（C-15），28.1（C-16），50.8（C-17），15.0（C-18），182.3（C-19），36.7（C-20），19.2（C-21），40.2（C-22），128.7（C-23），138.1（C-24），75.3（C-25），26.5C-26），26.9（C-27），24.2（C-28），21.3（C-29），19.7（C-30），50.5（25-OCH3）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为25-Omethylkaravilagein D［21］。

化合物8：白色无定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.25（1H，dd，J= 9.7，2.0 Hz，H-6），5.66（1H，m，H-7），5.64（1H，m，H-24），5.54（1H，m，H-23），3.23（6H，s，7-OCH3，25-OCH3），1.51（3H，s，H-29），1.35（6H，s，H-26，H-27），1.17（3H，s，H-28），0.99（3H，d，J= 5.5 Hz，H-21），0.94（3H，s，H-18），0.83（3H，s，H-30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：22.0（C-1），30.2（C-2），76.0（C-3），42.3（C-4），148.1（C-5），121.4（C-6），76.1（C-7），46.2（C-8），50.6（C-9），37.1（C-10），23.0（C-11），29.7（C-12），46.3（C-13），48.3（C-14），35.4（C-15），28.0（C-16），50.6（C-17），15.4（C-18），207.6（C-19），36.7（C-20），19.3（C-21），40.1（C-22），128.8（C-23），138.1（C-24），75.2（C-25），26.5（C-26），26.9（C-27），27.7（C-28），26.6（C-29），18.6（C-30），56.3（7-OCH3），50.6（25-OCH3）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为（23E）-3β-hydroxy-7β，25-dimethoxycucurbita-5，23-dien-19-al［22］。

化合物9：白色无定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：5.83（1H，d，J= 5.0 Hz，H-6），5.57（2H，m，H-23，H-24），3.50（1H，m，H-3），3.43（1H，d，J=5.8 Hz，H-7），3.33（3H，s，7-OCH3），1.29（6H，s，H-26，H-27），1.20（3H，s，H-29），1.03（3H，s，H-28），0.97（3H，s，H-19），0.91（3H，s，H-18），0.88 （3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.69（3H，s，H-30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：22.2（C-1），29.6（C-2），76.5（C-3），42.4（C-4），148.5（C-5），120（C-6），78.0（C-7），49.3（C-8），34.8（C-9），39.8（C-10），33.3（C-11），30.8（C-12），46.7（C-13），48.7（C-14），35.4（C-15），28.3（C-16），50.1（C-17），16.0（C-18），30.6（C-19），37.1（C-20），19.4（C-21），40.0（C-22），124.7（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.3（C-26），31.3（C-27），28.8（C-28），26.7（C-29），18.5（C-30），56.6（7-OCH3）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为karavilagenin B［18］。

化合物10：白色无定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.33（1H，dd，J= 9.7，2.1 Hz，H-6），5.57（2H，m，H-23，H-24），5.50（1H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-7），4.57（1H，s，H-19），3.38（3H，s，19-OCH3），1.56（3H，s，H-26），1.56（3H，s，H-27），0.97（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），1.41，0.91，0.83，0.80（各3H，s，CH3-29，28，18，30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：17.5（C-1），28.2（C-2），76.7（C-3），37.9（C-4），85.7（C-5），134.0（C-6），130.9（C-7），50.2（C-8），49.7（C-9），38.6（C-10），22.3（C-11），31.3（C-12），45.7（C-13），48.6（C-14），34.0（C-15），28.4（C-16），50.7（C-17），15.5（C-18），115.3（C-19），37.9（C-20），19.2（C-21），39.9（C-22），124.6（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.0（C-26），31.0（C-27），24.8（C-28），21.0（C-29），20.5（C-30），57.6（19-OCH3）。以上波谱数据与相关文献报道的一致，故鉴定其为（19S，23E）-5β，19-epoxy-19-methoxycucurbita-6，23-dien-3β，25-diol［23］。

2.3 化合物体外抗肝纤维化活性的筛选

用 MTT 法测定单体化合物1～7 对t-HSC/Cl-6细胞增殖的抑制作用，选用水飞蓟素作为阳性对照药，将化合物配制成浓度为0、10、30、60、100 μmol·L-1的溶液进行实验。

取对数生长期的大鼠肝纤维化细胞t-HSC/Cl-6 细胞，经胰酶消化后接种于96 微孔板上，于37 ℃下恒温培养12 h 后，除去培养液，每孔加入不同浓度药物10 μL，每组设3 个复孔。在37 ℃、体积分数为5% 的CO2下恒温培养48 h 后，加入质量浓度为5 mg·mL-1的MTT 溶液10 μL，在37 ℃下恒温培养4 h 后，小心吸弃孔内上清液，每微孔加入DMSO 100 μL，轻微振摇后放置15 min，使甲瓒结晶能够充分被DMSO 溶解。将96 微孔板置于酶标仪上，在490 nm 波长处检测各孔的吸光度（A）值。并计算IC50值，结果见表1。结果表明，化合物1 和化合物2 对t-HSC/Cl-6 细胞具有一定的抑制活性（IC50＜ 30.0 μmol·L-1）。

表1 化合物1～7 对t-HSC/Cl-6 细胞48 h 的IC50值 （±s，n = 3）Tab.1 IC50 values in 48 hours of the compounds 1-7 on t-HSC/Cl-6 cells （±s，n = 3）

表1 化合物1～7 对t-HSC/Cl-6 细胞48 h 的IC50值 （±s，n = 3）Tab.1 IC50 values in 48 hours of the compounds 1-7 on t-HSC/Cl-6 cells （±s，n = 3）

化合物1234 IC50/（μmol·L-1）25.9 ± 2.6 26.2 ± 2.8 79.5 ± 4.4 31.2 ± 2.0化合物567 silymarin IC50/（μmol·L-1）38.8 ± 5.7 137.1 ± 6.4 130.2 ± 5.4 195.5 ± 22.6

3 讨论

本文对苦瓜未成熟果实酸水解后的化学成分及其抗肝纤维化活性进行了研究，得到了10 个葫芦烷型三萜皂苷元，化合物1 和化合物2 为首次从该植物中分离得到。活性筛选发现化合物1 和化合物2 对t-HSC/Cl-6 细胞有明显的增殖抑制活性，其余化合物也对t-HSC/Cl-6 细胞有不同程度的增殖抑制活性。就目前报道的从苦瓜中得到的葫芦烷型化合物而言，根据其母核结构特点，可分为两大类：第一类的主要特征是C-5 与C-19 位由一个氧连接形成呋喃环，且C-6 和C-7 之间形成双键，再根据C-3、C-7 和C-19 位上的氧化程度加以区分；第二类的主要特征是C-5 和C-6 之间形成双键，再根据C-19 位上的氧化程度不同加以区分。母核结构不同，构效关系也不同，比如化合物1～3、5～7，属于第一类母核结构的化合物，分析结构与活性发现在该母核结构中，侧链有2 个双键形成共轭结构化合物的活性要优于侧链仅有1 个双键的化合物，表明共轭结构能够增强葫芦烷型化合物对t-HSC/Cl-6 细胞的增殖抑制活性。对构效关系更深入地研究将扩大葫芦烷型化合物的结构多样性，未来会进一步探讨。