基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 比较不同产地黄芪饮片的成分差异

刘 倩,李 格,张 静,兰银银,韩福国,范雪梅,郝艳丽,刘清飞,3*

1.陕西中医药大学药学院，咸阳 712046；2.清华大学药学院，北京 100084；3.清华大学北京市中医药交叉研究所，北京100084

黄芪是常用的传统中药之一，为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. 的干燥根；性微温，味甘，归脾、肺经，有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水退肿之功效［1］。现代药理学研究表明，黄芪主要含有皂苷、黄酮、氨基酸以及多糖等多种活性成分，具有抗肿瘤、抗衰老、调节免疫、降血压等药理作用［2］。黄芪在我国分布较广，如甘肃、山西、陕西、内蒙古、东北等地，各地区海拔、土壤、光照等环境条件不同，导致各产地黄芪药材及饮片的质量与等级也有显著差异［3］。目前，有研究用高效液相色谱、超高效液相色谱等技术比较不同产地黄芪水提取液、醇提取液等化学成分，证实在各地黄芪中部分成分存在含量差异，为研究不同产地黄芪质量控制与评价提供了一定科学依据，但大多数研究仅对含量较高的化合物进行分析，并不全面［4-7］。因此，本研究以黄芪的3 个重要产地（山西浑源与朔州、甘肃渭源与岷县、陕西子洲）所产的黄芪饮片为研究对象，用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）液质联用系统全面检测黄芪的化学成分，并用偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等统计学方法全面分析3 个产地黄芪饮片的化学成分差异，为不同产地黄芪饮片的基原鉴定与质量研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液质联用系统：Ultimate 3000 型超高效液相色谱仪（美国Dionex 公司）串联Thermo Q Exactive Plus 型高分辨质谱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RT-12SF粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；MS104S 分析天平（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LD5-2B 离心机（北京市京立离心机有限责任公司）。

1.2 试药

15 批黄芪饮片分别由北京市万泰利克药业有限公司、陕西子洲县永盛黄芪种植农民专业合作社提供，分别来源于甘肃、山西、陕西3 个省的主产地，为豆科植物蒙古黄芪的干燥根，见表1。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备

取黄芪饮片适量，粉碎过60 目筛，再取过筛粉末约1 g，精密称定，加甲醇10 mL，称定质量，浸泡30 min，超声提取1 h，称定质量，加甲醇补足减失的质量，以4 000 r·min-1离心10 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温为30 ℃；流速为0.2 mL·min-1；流动相为0.1 mL·L-1甲酸-乙腈（A）-0.1 mL·L-1甲酸水（B），梯度洗脱：0～10 min，100%B；10～20 min，100%～70% B；10～25 min，70%～60%B；25～30 min，60%～50%B；30～40 min，50%～30%B；40～45 min，30%～0%B；45～60 min，0% B。二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）的扫描波长设为190～400 nm。

表 1 黄芪饮片的来源Tab.1 Source of Astragali radix decoction pieces

2.3 质谱条件

离子源：加热电喷雾离子化源（heated elektrospray ionization source，HESI）；鞘气流量为40 arb，辅助气体流量为15 arb，毛细管温度为320 ℃，辅助气体加热器温度为350 ℃，正喷雾电压为3.2 kV，负喷雾电压为3.0 kV。MS 的分辨率为70 000，MS/MS 的分辨率为17 500，扫描方式为全扫描模式，正、负离子模式同时检测，扫描范围m/z100～1 500。

2.4 数据处理及统计学方法

化合物用Compound Discover 3.1，m/zCloud 和m/zVault 数据库进行鉴定，并与TCMSP 数据库及文献中黄芪化学成分进行比对。用SIMCA 软件对所得化合物进行PLS-DA 分析，以VIP 值反映化合物对分组的贡献大小，并进一步用t检验对差异成分进行显著性分析，最终以VIP＞1、P＜0.05 为标准，筛选不同产地黄芪的差异成分。对不同产地黄芪的差异成分用SIMCA 再次进行PLS-DA 分析，绘制得分图、聚类树状图、Bipolt 图，分析得不同产地的代表性差异成分。用Origin 软件绘制差异成分热图，以更直观地分析不同产地黄芪的差异成分的含量差异。

3 结果与分析

3.1 化学成分的鉴定

甘肃、山西、陕西3 个产地黄芪饮片的总离子流图见图1。

图1 正负离子模式下3 个产地黄芪UHPLC-MS 总离子流图Fig.1 UHPLC-MS TIC of Astragali radix decoction pieces from 3 origins in positive and negative ion modes

从正、负离子流图可知，不同产地黄芪图谱整体轮廓大致相似，但部分化合物峰高有差异。原始图谱信息与Compound Discover 3.1、m/zCloud、m/zVault、TCMSP 数据库及文献中黄芪化合物信息进行比对，共鉴定出107 个化合物，并以相对分子质量由小到大对化合物进行编号。

3.2 差异化合物的筛选及鉴定

用有监督的PLS-DA 方法分析数据，所得模型参数为R2Y（cum）=0.935，Q2（cum）=0.202。PLSDA 得分图见图2。由图2 可知，甘肃、山西产地5 个批次的黄芪较为分散，陕西子洲产地5 个批次的黄芪较为聚集且与其他2 个产地距离较远。进一步计算各个化合物的VIP 值、组间统计学差异，发现同时符合VIP＞1 且P＜0.05 的成分共有21 个，主要涉及氨基酸、糖、酚酸、黄酮、维生素、木脂素、三萜等化合物，其中1 个成分在甘肃、山西2 个产地差异有统计学意义；11 个成分在山西、陕西2 个产地差异有统计学意义；18 个成分在甘肃、陕西2 个产地差异有统计学意义，见表2。其中叶酸仅在陕西子洲产地检测到，其余20 个成分在3 个产地的黄芪中均存在，但含量有差异，见图3。

图2 PLS-DA 得分散点图Fig.2 PLS-DA score scatter plot

图3 不同产地差异化合物的韦恩图Fig.3 Venn diagram of differential compounds of different origins

表2 21 个差异化合物的信息Tab.2 Information of 21 differential compounds

3.3 差异成分的研究

基于21 个差异化合物对15 批样本进行聚类，区分不同产地黄芪饮片的潜在指标成分。PLS-DA 法所得模型参数为R2Y（cum）=0.837，Q2（cum）=0.482，得分图见图4。聚类分析树状图见图5。由图5 可知，21 个差异化合物可将3 个不同产地的黄芪区分开。若分为2 类，仅有陕西子洲与甘肃明显区分开；若分为4 类，陕西5 批可聚为一类，甘肃5 批聚为一类，山西S-3、S-5 聚为一类，但与陕西相近，山西S-1、S-2、S-4 聚为一类，但与甘肃相近。

图4 差异成分得分散点图Fig.4 Score scatter plot of differential compounds

图5 差异成分的聚类树状图Fig.5 Hierarchical cluster analysis for differential compounds

Biplot 图见图6。由图6 可知，各差异化合物与产地越接近表明成分与该产地相关性越强，含量也越高。热图中颜色越红，表明含量越高。差异成分热图见图7，结合Biplot 图及热图可知，有12 个差异化合物在陕西子洲黄芪中含量高于其他产地。其中阿拉伯糖（15）、维生素B2（64）、叶酸（74）、黄芪异黄烷苷（85）、柚皮苷（90）、沙苑子苷（94）在陕西子洲与其他2个产地的含量差异有统计学意义，可作为陕西子洲黄芪潜在指标性成分；羽扇豆醇（70）、4-羟基肉桂酸（17）、精氨酸（20）、胱氨酸（26）、γ-氨基丁酸（1）、丝氨酸（3）、鹰嘴豆芽素A（43）、芒果苷（69）、L-乙酸冰片酯（25）9 种差异化合物在甘肃黄芪中含量较高，但其中羽扇豆醇与其他2 个产地含量差异均无统计学意义，无法区别于其他2 个产地。刺芒柄花素（35）、刀豆氨酸（21）等化合物在山西黄芪中含量较高。

图6 差异成分的Biplot 图Fig.6 Biplot plot of differential compounds

图7 差异成分热图Fig.7 Heat map of differential compounds

将差异性成分的峰面积用Origin 软件进行归一化处理，再对甘肃、山西、陕西3 个产地含量较高的显著差异成分的相对含量进行比较分析，结果见图8、图9。结果显示，甘肃产地黄芪中4-羟基肉桂酸含量显著高于山西产地；精氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、鹰嘴豆芽素A、芒果苷、L-乙酸冰片酯含量显著高于陕西子洲产地。相对甘肃、山西2 个产地的黄芪，陕西子洲黄芪中阿拉伯糖、维生素B2、叶酸、黄芪异黄烷苷、柚皮苷、沙苑子苷的含量相对较高，可作为陕西子洲黄芪潜在质量指标成分。

图9 陕西子洲产黄芪饮片含量较高的成分归-化峰面积柱状图Fig.9 Histogram of normalized peak areas of components with higher content of Astragali radix decoction pieces from Zizhou in Shannxi

4 讨论

黄芪为临床常用中药材，产地多，分布广，其品种、品质、规格等亦多有不同。陕西、山西、甘肃作为黄芪的重要产区，地理位置（如经度与纬度、坡向与坡度等），气候特征（如干旱与潮湿等），以及生长采收年限不同等，导致各地黄芪药材及饮片质量存在显著差异。陕西子洲黄芪为蒙古黄芪，生长于干旱的坡地，为半野生黄芪，生长年限大多超过5年，于2008年被批准为国家地理标志保护产品；山西恒山黄芪为蒙古黄芪，生长于干旱的坡地，为半野生黄芪，生长年限大多超过5年，于2014年被批准为国家地理标志保护产品，亦有部分家种黄芪，通常栽培2～3年；甘肃陇西黄芪主要为蒙古黄芪，生长于相对潮湿的平地，为栽培黄芪，生长年限为2年［8-9］。此外，从历代本草有关黄芪产地的记述可以看出，黄芪的道地产地随朝代的变更而变迁［10-11］，加之人工栽培所用种子来源多元化，为当地饮片的质量控制带来一定困难。例如随机采集甘肃主栽地区的黄芪资源，样品中蒙古黄芪、膜荚黄芪所占比例最高，分别为59.65%、36.84%，剩余红芪及东俄洛黄芪占3.51%［12］。为此，加强对黄芪基原与质量的研究，从而为黄芪药材饮片的质量控制提供参考尤为必要。近年来多数研究基于UPLC-MS、核磁指纹图谱、SSR 分子标记技术等方法从多指标含量测定、炮制前后化学组分对比等方面对黄芪饮片基源及质量进行研究［4-5，13-15］。本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液质联用技术分析比较甘肃、山西、陕西3 个不同产地黄芪饮片的成分差异，通过数据库及文献对比鉴定出108 个化学成分，并经组间比较及统计学分析筛选出21 个显著差异化合物，可作为特征成分对3个产地的黄芪饮片进行区分，为黄芪饮片的来源鉴定与质量评价提供参考。从差异化合物聚类分析图可发现，21 个差异化合物可将甘肃、山西、陕西3 个不同产地黄芪饮片区分，但同一省不同地区黄芪并未有所区分，如山西浑源S-5 与山西朔州S-3 聚为一类，甘肃渭源G-2 与岷县G-3 聚为一类，表明同省内黄芪饮片质量无明显差异。因此本文重点分析3 个不同省份所产黄芪饮片的成分差异。

21 个差异化合物中有6 个成分在陕西子洲黄芪中的含量均显著高于甘肃、山西2 个产地的黄芪，分别为沙苑子苷、叶酸、黄芪异黄烷苷、柚皮苷、阿拉伯糖、维生素B2，推测这几种成分既可区别陕西子洲与其他产地所产黄芪，也可用于黄芪种源鉴定。上述黄芪异黄烷苷、沙苑子苷和柚皮苷属于黄酮苷类，通过网络药理学及分子对接技术预测黄芪异黄烷苷具有治疗儿童肥胖症、糖尿病周围血管疾病等药理作用［16-17］，有研究报道，沙苑子苷能很好地与促进肿瘤血管形成的相关靶点结合，可调控原癌基因酪氨酸蛋白激酶（ABL1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）［18］。柚皮苷可对某些毒物产生拮抗作用，还具有降血脂、降胆固醇、抗骨质疏松、抗动脉粥样硬化等作用［19］。维生素B2是体内多种氧化酶系统不可缺少的辅酶，其对维持人体正常物质代谢和某些特殊生理功能是不可缺少的［20］。黄芪异黄烷苷、柚皮苷、沙苑子苷等6 种差异成分在陕西子洲产的黄芪中含量较高，且具有多种药理活性，也表明陕西子洲的黄芪饮片在抗癌、免疫调节、降血脂等作用方面较有优势。

其次，21 个差异化合物中可区别于甘肃、山西产地蒙古黄芪的成分仅有4-羟基肉桂酸，但甘肃黄芪与陕西子洲黄芪无显著差异，推测此成分可能受甘肃地理环境影响，种源间差异较小，可作为甘肃蒙古黄芪饮片的质量标志物之一。4-羟基肉桂酸又称对羟基肉桂酸，可通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，达到预防和治疗色素沉着、黑色素瘤等目的［21］。刘利娜［22］研究发现，滇桂艾纳香中的酚酸（对羟基肉桂酸）具有显著的抗血小板活性。甘肃产黄芪中精氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、鹰嘴豆芽素A、芒果苷、L-乙酸冰片酯含量显著高于陕西子洲产黄芪，可分为氨基酸类、黄酮类等，但含量与山西产黄芪无显著差异，推测这几种成分也可作为黄芪种源鉴定的特征性成分。氨基酸结构具有既含羧基又含氨基的特点，在调节激素分泌及合成、调节能量代谢、抗肿瘤、调节血压、提高记忆力等方面有重要药理作用［23-24］。据报道，鹰嘴豆芽素A 可通过限制糖酵解和线粒体氧化磷酸化等抑制胶质母细胞瘤的生长［25］。芒果苷又称莞知母宁，是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，具有良好的降糖活性，可通过增加小鼠成肌细胞葡萄糖吸收以及改善细胞胰岛素抵抗活性等发挥降糖作用［26］。由此可推测，甘肃黄芪可能在抗肿瘤、调节内分泌以及降血糖等方面具有较强的药理活性。山西产地黄芪中刺芒柄花素含量显著高于陕西子洲产地，但与甘肃产地无明显差异，刺芒柄花素为异黄酮类化合物，也是黄芪的主要成分之一，研究表明，其在抗炎、抗氧化应激、神经组织修复、抗癌等方面有重要作用。LI Z 等［27］研究发现刺芒柄花素可通过抑制白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）进而抑制神经炎症反应，从而发挥其神经保护作用。其还可通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（E2-related factor 2/hemo oxygenase-1，Nrf2/HO-1）信号通路改善肾功能、降低血糖血脂、抑制肾组织氧化［28］。其在结肠癌、胃癌、外阴鳞癌等疾病中可抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡活性［29-31］，推测山西产黄芪可能在此类药理作用方面有更强的活性。

综上所述，基于PLS-DA 等分析方法得到21 个差异性化合物，可对不同产地黄芪道地性指标奠定理论基础，并且差异化合物分类广泛，涉及维生素、黄酮及其苷类、糖等，表明不同产地代表性差异成分可能在对应药理作用方面具有临床治疗意义，也为深入研究其药理作用提供思路。2020年版《中华人民共和国药典》规定黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷为黄芪含量测定指标，而本研究中3 个产地的15批样本中，黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均未见显著性差异，表明仅以该2 种成分并不能有效区分不同产地的黄芪饮片，与文献报道的甘肃与内蒙古产黄芪上述2 个指标差异无统计学意义相一致［32］。本研究为黄芪饮片的质量控制与评价纳入更多活性强、含量高的有效成分提供理论依据。但研究每个产地仅购入5 批黄芪，样本量小，今后应购入不同产地更多批次的黄芪来验证本文分析所得的潜在质量标志物的准确性。 本文仅基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液质联用技术进行差异化合物检测及分析，今后可进一步运用红外、液质联用、核磁共振等多种方法，并且结合多糖、蛋白、微量元素等物质基础对黄芪饮片的道地性及种源方面进行更系统、全面地研究。