电针对失神经肌萎缩大鼠自噬相关因子的影响*

张淑芳,李 童

(湖北中医药大学,湖北 武汉 430072)

目前,对于失神经病变导致的骨骼肌萎缩,在临床上尚无有效的药物治疗措施。而针刺,尤其是电针,是现在治疗肌萎缩的一种常用方法,有着较好的疗效。电针刺激“阳陵泉”和“足三里”穴后,能够上调糖尿病肌病模型中萎缩肌肉IGF-1、Akt及p70S6k的表达,缓解因糖尿病引起的骨骼肌萎缩,促进肌肉再生[1]。电针干预还可上调衰老性肌萎缩大鼠骨骼肌中mTOR和磷酸化mTOR的表达水平,继而阻止肌萎缩的进一步发生[2]。在周围神经损伤大鼠模型中,发现电针能够提高细胞自噬反应,有利于坐骨神经功能及组织形态的修复,从而延缓其靶器官骨骼肌的萎缩[3]。但在失神经肌萎缩状态下,自噬会过度激活,而电针可通过抑制自噬相关基因,下调自噬水平,从而达到维持骨骼肌细胞稳态并延缓肌萎缩的发生[4]。因此,自噬活性适度与过度的界定是针刺防治骨骼肌萎缩进一步深入研究和探讨的方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象及试剂仪器

由辽宁长生生物技术股份有限公司提供的雄性SD大鼠36只,SPF级,体质量为(350±10)g,代养于湖北中医药大学动物实验中心SPF级动物房。

主要仪器:华佗牌无菌针灸针,为苏州医疗用品厂有限公司生产;HANS-200A穴位神经刺激仪为联创科技(集团)南京济生医疗科技有限公司生产。主要试剂:苏木素染液(AS1055A)、伊红染液(AS1094),均来自武汉阿斯本生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 失神经肌萎缩动物模型的建立

大鼠适应性喂养1周后,随机分为3组:假手术组(n=12)、模型组(n=12)、和模型电针组(n=12)。参考并复制朱正威等[5]的造模方法,制备大鼠失神经性肌萎缩模型。

1.2.2 电针干预方法

造模后第2d,将电针组大鼠置于固定器上,取穴方法依照《实验针灸学》[6],选取大鼠右侧“足三里”穴和“环跳”穴进行电针干预,使用一次性无菌针灸针直刺5～7mm,然后接上电子针疗仪,使用连续波,频率2Hz,电流强度1.0mA,每次10min,1次/d,共干预14d。假手术组和模型组大鼠每日采取相同方法固定,但无电针干预。

1.2.3 取材

电针干预14d后,将各组大鼠进行腓肠肌标本取材。手术完整剥离双侧腓肠肌,PBS冰浴后,用滤纸吸干表面残液,剔除其表面多余肌腱及血管,于电子天平器上称取双侧腓肠肌湿重并记录数据(反复称量3次,选择平均值);随后将标本放置冻存管中于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 Western blotting法

剪切0.3g组织+800μL裂解液+8μL蛋白酶抑制剂,放入打样管,加入磁珠,匀浆机充分匀浆,进行蛋白总样品的制备。随后进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、抗体孵育和免疫反应等,最后加入发光剂,拍摄成像。本实验所用一抗来源为Bax(CST,2772)、LC3(CST,12741)、Atrogin-1(Ls-c18343)、Bcl2(SC-492)。

1.3 统计学方法

实验所得数据用GrapdhPad Prism 7统计处理,数据以(均数±标准差)表示。使用单因素方差分析,对各组间进行比较,P<0.05设定为具有显著性差异。

2 结 果

2.1 电针干预提高了失神经肌萎缩大鼠骨骼肌湿重比值

如表1所示,与假手术组相比,模型组与电针组的湿重比显著下降(P<0.05),电针组与模型组相比,湿重比显著性上升(P<0.05),表明电针干预有利于腓肠肌肌萎缩的修复。

表1 电针干预后失神经肌萎缩大鼠腓肠肌质量变化(n=12)

2.2 电针对肌纤维结构的影响

通过HE染色发现,电针使肌肉组织形态学发生了改变。具体表现为:假手术(C)组腓肠肌肌纤维形态规则,细胞核分布正常,胞质染色均匀。而在模型组(M)中,可观察到其肌纤维的横切面上形态大小不一,细胞边界不清晰,同时伴有肌束间结缔组织的增生。电针组(E)与模型组(M)相比,其肌组织受损程度减轻,见图1。

C.假手术组;M.模型组;E.电针组。

2.3 电针使失神经肌萎缩大鼠中腓肠肌组织细胞自噬和细胞凋亡水平下降

如图2所示,与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌组织中Bcl2显著下降(P<0.05),同时Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Atrogin-1的表达上升(P<0.05)。与模型组相比,电针组大鼠腓肠肌组织中Bcl2表达增加(P<0.05),而Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Atrogin-1的表达下降(P<0.05)。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的下降,反映了电针降低了失神经肌萎缩大鼠腓肠肌组织中的自噬水平。Bcl2表达增加和Bax的下降,反映电针降低了失神经肌萎缩大鼠腓肠肌组织中的凋亡水平。

C.假手术组;M.模型组;E.电针组(与C组比较,*P<0.05;与E组比较,#P<0.05,n=12)。

3 讨 论

中医学将失神经性肌萎缩归为“痿症”范畴,失去神经支配后的骨骼肌肌纤维变细甚至消失为其典型的病理特征[7]。在本实验中,采用离断坐骨神经的方法制备了右侧腓肠肌失神经肌萎缩模型。结果发现,模型组与假手术组相比,腓肠肌质量患侧/健侧显著性下降,同时可观察到模型组骨骼肌肌纤维结构发生了明显的变化。说明此坐骨神经离断方法可导致大鼠骨骼肌肌纤维的损失,能较好地模拟失神经肌萎缩模型。

大量研究表明[8-9],泛素连接酶MAFbx/Atrogin-1在各种萎缩状态中被激活,如长时间的肌肉制动、sarcopenia和癌症恶病质。诱导肌萎缩后,肌肉特异性泛素酶Atrogin-1和MuRF1的缺失会减轻肌肉萎缩的发生。与之前的报告相同,本研究中发现,与对照组相比,去神经支配的大鼠腓肠肌组织Atrogin-1表达显著增加。Atrogin-1是重要的肌肉特异性E3连接酶,它通过泛素-蛋白酶体系统在肌肉收缩蛋白的降解中发挥重要作用。而通过针刺治疗后,Atrogin-1表达显著下降,腓肠肌湿重比相对模型组显著上升。表明电针可能通过下调肌萎缩蛋白Atrogin-1以减轻肌肉收缩蛋白的降解,缓解失神经肌萎缩的发生。LC3是第一个被发现的自噬体标记蛋白。当自体吞噬发生时,Ⅰ型LC3经泛素样加工修饰过程,与自噬表面的磷脂乙醇胺(PE)结合,形成Ⅱ型LC3。LC3-Ⅱ结合并始终位于胞内自噬体的膜上,其含量与自噬泡数量呈正比,因此,LC3的表达强度与自噬活性密切相关。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调是自噬激活的典型标志。

Bcl-2家族可以分为两类:一类为抗细胞凋亡蛋白,其代表是Bcl2蛋白;另一类是促细胞凋亡蛋白,其代表是Bax蛋白。它们通过一系列下游基因发挥调节凋亡作用[10]。Beclin1是自噬体形成过程中的一个必需分子,它能够介导其它自噬蛋白定位于吞噬泡从而调控哺乳动物自噬体的形成与成熟[11]。Bcl2家族蛋白与Beclin1结合并破坏Beclin1和Vps34之间的相互作用,从而抑制自噬体的形成。Beclin1-Bcl2复合物在细胞内发挥变阻器功能,保证细胞自噬水平维持在生理稳态范围内,而不会超出非生理性范围诱发细胞死亡[12]。本研究发现,去神经支配后大鼠腓肠肌LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl2上调,Bax蛋白含量下降,表明去神经支配后骨骼肌自噬水平上调,这可能会造成细胞过度的自我消化和重要的细胞内组分的降解,从而导致细胞死亡。而针刺可能通过抑制蛋白质降解系统来减轻去神经支配诱导的细胞过度死,以减轻骨骼肌的萎缩过程。