小反刍兽疫及其诊断与防治的研究进展

王永刚，于恒智，程 玮，孙芳芳，李晓佳，陶 青，孙 妍

（ 1. 中华人民共和国沈阳海关，辽宁 沈阳 110623 ； 2. 辽宁省农业经济学校，辽宁 锦州 121007 ）

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的以腹泻、口炎、发热和肺炎为特征的一类传染病，山羊发病比较严重，病死率可超过90%。小反刍兽疫的潜伏期为2～7 d，动物感染后还会出现大肠埃希氏菌、支原体等的混合感染[1]。截至目前，全世界有70 多个国家和地区发生过小反刍兽疫[1]。世界动物卫生组织规定小反刍兽疫为必须上报的动物疫病，我国将其列为一类传染病。高死亡率和高发病的发病特点给小反刍兽疫的诊断及治疗带来巨大挑战，根除小反刍兽疫已成为世界各国的共同目标。2015年，联合国粮食及农业组织和世界动物卫生组织联合发布了《小反刍兽疫全球控制和根除战略》，旨在于2030年前在世界范围内消灭小反刍兽疫[2]。本文综述了小反刍兽疫病毒的病原学特征、流行病学、临床症状，总结近年来小反刍兽疫的诊断及防治方法的研究进展，以期为相关疾病在临床中的诊断治疗提供参考。

1 小反刍兽疫病毒的病原学特征

小反刍兽疫病毒是副黏病毒科、麻疹病毒属病毒，此毒属还包括犬瘟热病毒、牛瘟病毒、海象瘟病毒。小反刍兽疫病毒基因组为单股负链无节段RNA，长15 948 bp。

1.1 小反刍兽疫病毒基因组结构

小反刍兽疫病毒编码6个结构蛋白和2个非结构蛋白以及1个血清型、4个基因谱系。两个非结构蛋白为C蛋白和V 蛋白（由P基因编码）；6 个结构蛋白为磷蛋白（P 蛋白）、大蛋白（L蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）、融合蛋白（F蛋白）、血凝素蛋白（H蛋白）和基质蛋白（M蛋白）。4个基因谱系中的Ⅲ型流行于西亚、西非地区，Ⅰ型和Ⅱ型主要流行于西非部分地区，Ⅳ型流行于中东地区[3]。

1.2 小反刍兽疫病毒编码蛋白功能

V 蛋白和C蛋白在结构功能上类似，与病毒逃避宿主免疫相关；H 蛋白和F 蛋白在小反刍兽疫病毒侵染的过程中起到黏附和侵入靶细胞的作用；L 蛋白和P 蛋白一起完成病毒的复制、转录、mRNA 帽子结构的功能；此外，M 蛋白是维持病毒颗粒稳定的蛋白，起到连接N蛋白与表面糖蛋白的作用；C 蛋白调控病毒RNA 合成，能够使成熟病毒颗粒顺利出芽。N 蛋白是分型蛋白[3]。C蛋白和V 蛋白比较保守，与病毒在宿主体内的复制和致病性具有一定关系[4]。Enchery 等[5]发现，不同小反刍兽疫病毒毒株之间存在一定的交叉保护。

1.3 小反刍兽疫病毒复制过程

小反刍兽疫病毒首先通过H 蛋白和N 蛋白与细胞表面受体结合，引起F 蛋白构象发生改变并释放融合肽，使病毒包膜与细胞膜发生融合，之后释放螺旋化的核衣壳到胞质中，从而开始病毒转录[6]。

2 小反刍兽疫的流行病学特征

2.1 传染源

小反刍兽疫潜伏期通常为4～6 d，《陆生动物卫生法典》表述潜伏期最长为21 d，传染源多为隐性感染动物或患病动物。

2.2 传播方式

小反刍兽疫多通过与病羊直接接触传播，此外，接触传播（消化道和呼吸道）与被病毒污染的饲料饮水等发生间接接触也会造成该病传播。

2.3 流行情况

小反刍兽疫最早发现于西非，是WOAH 提供官方认证的7 种疫病之一[7]。目前，WOAH 认证的小反刍兽疫无疫国为57个，无疫区域1个。我国小反刍兽疫疫情流行分3个阶段：2007—2010年，小反刍兽疫疫情传播到我国西藏自治区；2013—2015年，新疆首次发现该疫病，随后全国开始流行，涉及23 个省、自治区、直辖市[8]；2016 年至今呈散发状态。2016—2022 年间，我国发生32 起小反刍兽疫疫病，大部分发生在新疆维吾尔自治区[9]。

3 小反刍兽疫的临床症状

山羊的临床症状比较典型，绵羊一般较轻。感染动物的临床症状与牛瘟病牛类似。小反刍兽疫根据症状可分为温和型、标准型和急性型。最明显的病理变化为结膜炎和坏死性的口炎；皱胃病变较为明显，表现为糜烂，有出血斑点；大肠，尤其是结肠直肠交界处会出现斑马条纹或特征性出血，还可见脾脏肿大和肠系膜淋巴结水肿。

4 小反刍兽疫诊断方法的研究进展

小反刍兽疫是目前制约养羊业发展的主要因素之一。生产实际中，快速诊断对于该病的防控至关重要。小反刍兽疫实验室常规检测方法包括病毒中和试验（VNT）[10]、琼脂凝胶扩散试验（AGID）[11]和对流免疫电泳试验（CIE）、免疫荧光抗体检测试验（FAT）[12]、重组酶聚合酶扩增（RTRPA）、逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）[13]、酶联免疫吸附试验（ELISA）[14]、聚合酶链反应（PCR）[15]、化学发光免疫分析法（CLIA）[16]、胶体金免疫层析技术（GICA）和量子点免疫层析法（QD-LFMA）[17]。

4.1 VNT

VNT 是WOAH 建议的抗体检测金标准，原理是使用已知病毒检测待检血清的中和抗体，此方法敏感性高、特异性强，但费时费力，不适合大规模检测[18]。但许多新的检测方法需要与之进行比较[19]。

4.2 AGID和CIE

AGID 和CIE 均为检测病毒抗原的方法。AGID 是一种廉价、简便、适用于野外或在实验室内进行的小反刍兽疫病毒检测技术，可检查肛门排泄物、眼鼻口分泌物和病变组织，但存在时间长、灵敏度低等问题。CIE是检测病毒抗原最快速的方法。与免疫层析法、ELISA 法、核酸法相比，CIE 和AGID 法的灵敏度较低。因此，CIE 和AGID 不是小反刍兽疫病毒感染早期快速检测的最佳方法[9]。

4.3 FAT

该方法操作简单快捷，但需要荧光显微镜观察结果[9]。先用荧光物质在已知的抗原或抗体上做标记，利用抗原抗体反应原理，检查组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织或细胞。

4.4 RPA

目前已建立了多种小反刍兽疫病毒的RPA检测方法。如李园丽[20]创建以P 基因作为检测对象，检测低限为0.326 TCID50/mL 或14.98 拷贝数的小反刍兽疫病毒实时RT-RPA。Yang 等[21]开发的LFS RT-RPA 检测方法能够检测小反刍兽疫病毒N基因。但RPA 临床和现场测试尚不够成熟[9]，仍有待进一步开发和研究。

4.5 RT-LAMP

RT-LAMP是能够在恒温条件下进行快速扩增核酸序列的技术，对小反刍兽疫病毒的M基因和N基因在原有的基础上增加了逆转录酶以达到直接扩增的目的。范晴等[22]建立一种可视化多重荧光RT-LAMP方法用于检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒，该方法对小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒高度特异，与口蹄疫病毒、鹿流行性出血热病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反刍动物病毒均无交叉反应，检测灵敏度为200 copies/μL，干扰性小，可同时检测两个不同浓度的模板。张忠湛[23]设计了一种用于检测小反刍兽疫病毒的LAMP 反应体系并进行了优化，在62 ℃40 min 内即可完成扩增反应，可检测到1.6 个TCID50小反刍兽疫病毒。LAMP 对PCR 的敏感性是常规RT-PCR 的10 倍以上，其敏感性与荧光RT-PCR 相当[21]，但该试验引物设计复杂，稳定性不足，易出现假阳性[8]。

4.6 ELISA

小反刍兽疫病毒中最具抗原性的是核衣壳蛋白，常用于抗原检测。Libeau 等[24]建立了基于小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体的免疫捕获ELISA，可以快速精确地鉴别小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒（RPV）两种病原体。夹心ELISA也常用于进行病毒抗原检测，灵敏度比Vero细胞分离病毒法高。孙洁等[25]制备了针对小反刍兽疫病毒全病毒特异性卵黄抗体，利用PPRV N 蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY 为主要材料，建立了PPRV 双夹心ELISA 检测方法检测小反刍兽疫病毒。该方法可以特异性检出小反刍兽疫病毒而与其他病毒间无交叉。基于小反刍兽疫病毒M、N 蛋白单克隆抗体的dot-ELISA 也常用于田间检测，与夹心ELISA 相比，该法的特异性和灵敏性分别为91.0%和82.5%。

4.7 PCR

PCR 也是一种病毒核酸检测方法。师亚玲等[26]建立快速特异的小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法，与蓝舌病、口蹄疫、山羊痘、羊口疮等常见牛羊病毒均无交叉反应，具有良好的特异性、较高的敏感性和稳定性，可用于小反刍兽疫的初步筛查。Balamurugan等[27]设计了针对高度保守基因-N、M 两种基因的多重RT-PCR，该方法能够快速鉴别 RPV 和小反刍兽疫病毒两种病原体，避免了假阳性的结果。使用RT-PCR-ELISA 方法检测小反刍兽疫病毒N 基因灵敏性更高，比常规的琼脂糖电泳分析的RT-PCR方法高10 000倍。结果表明，这种方法在病毒浓度非常低的情况下也能准确地检测出病毒，大大提高了检测的灵敏度，可在早期发现病毒，从而为疾病的预防和治疗提供宝贵的时间。此外，该方法还具有较高的稳定性，可广泛应用于不同实验室和地区；但该方法容易污染，过程复杂，不适于小反刍兽疫病毒的高通量检测。总之，基于小反刍兽疫病毒N 基因的RT-PCR-ELISA 检测方法是一种高效、特异、灵敏的病毒检测技术，适用于小反刍兽疫病毒早期和晚期的检测，可鉴别RPV和小反刍兽疫病毒两种病原体，将有助于更好地防控小反刍兽疫病毒，保护畜牧业的发展和公共卫生安全。实时荧光RT-PCR 具有更高的灵敏度，如Batten 等[28]创建的基于N基因的实时荧光RT-PCR 可测出4 个谱系中的小反刍兽疫病毒株，其检测位点为N基因的N末端。

4.8 CLIA

CLIA是一种结合化学发光反应与免疫反应的免疫分析方法，具有灵敏度高、操作简便、分析简单、快速等特点，广泛应用于传染病的诊断。但这种方法对测试人员和仪器设备的要求均较高，不能广泛地应用于实际生产中[16]。

4.9 GICA和QD-LFMA

免疫层析是在免疫渗滤试验基础上建立的新型免疫分析法，为一种抗原检测方法。小反刍兽疫病毒检测中常见的是量子点及金标免疫层析技术。Chen 等[29]开发了可视化-化学发光双读的胶体金流动免疫层析，并在胶体金表面分别对其进行双重标记，从而达到双读和放大的目的。Cheng 等[17]利用量子点作为标志物，构建了一种新型的基于量子点的免疫层析检测新方法，该方法具有光谱范围广、荧光独特、荧光强等优点，其检测灵敏度较传统胶体金免疫色谱法高了一个数量级，可以满足大样本人群的检测需求，但是试剂价格偏高。

5 小反刍兽疫疫苗防控的研究进展

小反刍兽疫尚无有效的治疗方法，防控方法主要为疫苗免疫。我国已将小反刍兽疫纳入《2020年国家动物疫病强制免疫计划》，提出在全国范围内推广小反刍兽疫疫苗。小反刍兽疫病毒属麻疹病毒，小反刍兽疫病毒的疫苗的策略与其他麻疹病毒相同，可简单地分为3类。

5.1 传统疫苗

传统疫苗包括小反刍兽疫病毒弱毒疫苗、牛瘟弱毒疫苗和小反刍兽疫病毒灭活疫苗，是应用最广泛的疫苗，但无法将接种疫苗的动物与自然感染的动物区分开。接种牛瘟弱毒疫苗可获得良好的免疫保护作用。小反刍兽疫病毒弱毒疫苗可对不同群株进行交叉免疫，且无不良反应，但耐热性能较差。而小反刍兽疫灭活疫苗需要进行第二次免疫。

5.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗包括重组亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗和反向遗传学技术重组苗。

5.2.1 重组亚单位疫苗

以致病蛋白为基础构建的亚单位疫苗具有更高的安全性和更高的免疫保护能力，有望成为防治小反刍兽疫的理想疫苗[30]。目前，H 蛋白已被证明是最重要的免疫抗原[31]，以病毒为载体，研制出了一种能够有效预防绵羊感染小反刍兽疫的新型DIVA 疫苗，但该疫苗不能长期产生高水平抗体，有效保护周期存在一定的缺陷。

5.2.2 活载体疫苗

活载体疫苗包括痘载体疫苗和腺病毒载体疫苗。痘病毒基因组容量大，可载入大片段的外源基因，被用于构建基因载体病毒疫苗。痘病毒载体疫苗没有激活最佳的抗体反应，疫苗接种员存在安全风险。腺病毒载体疫苗能够诱导T 细胞产生强烈免疫反应，常用的为人5 型腺病毒[32]。重组腺病毒载体疫苗是一种高免疫原性的疫苗，可以引起获得性和先天的免疫反应，经常被用于区分接种后的动物和天然的动物[33]。

5.2.3 反向遗传学技术重组苗

利用反向遗传学技术，通过对病毒RNA 的结构进行改造，剔除抗原组分和增加标志基因，从而实现对小反刍兽疫病毒基因组的调控，为研制新型疫苗奠定基础[34]。利用反向遗传学方法构建的重组苗，其致病力退化的可能性较低，且不具有DIVA的功能，因而具有较高的安全性。采用反向遗传技术进行疫苗研制存在的问题是，若将标记蛋白与病毒囊膜结合，也许会改变宿主嗜性和致病力[33]。

5.3 多联苗

由于小反刍兽疫可与其他病毒发生并发感染，如口蹄疫病毒[35]、蓝舌病病毒[36]和山羊痘病毒[37]等，因此可使用多联苗诱导中和反应对抗多种小反刍动物疫病。多价苗的使用使疫苗接种更加便利，并且明显降低了疫苗成本，但免疫效果较差。

6 结论

小反刍兽疫作为一种危害比较严重的传染性动物疫病，已在非洲、欧洲及亚洲等70多个国家和地区发生，是目前制约养羊业发展的主要因素之一，给各国畜牧业发展均造成了一定的影响。在生产实践中，高效的疫苗免疫和快速、准确、特异和灵敏的检测技术可提高疾病的防治效果，控制小反刍兽疫的流行。世界动物卫生组织和联合国粮食及农业组织联合制定并实施了小反刍兽疫全球控制和根除策略，相信随着科学技术不断进步，小反刍兽疫的防控也将取得新进展。