蒲公英总黄酮的提取工艺优化及抗氧化活性评价*

刘思琳，高 原，武晓艺，徐 笛，陈子欣

（哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江省预防与治疗老年性疾病的药物研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.Mazz.），菊科蒲公英属的多年生草本植物，为黑龙江省道地药材。蒲公英全草可入药，药用价值高且分布广泛，易采摘收集。蒲公英具有清热解毒、消肿止痛、利胆利尿、轻泻健胃、消炎抑菌和预防癌症等功效[1-3]。现代医学研究表明，蒲公英具有多种药理活性，应用广泛，关于蒲公英及其活性成分开发及深加工也受到了人们的关注。蒲公英中含有蒲公英醇、蒲公英素等多种成份，同时含有丰富的矿物质、维生素和多种营养成分，蒲公英中富含黄酮、异黄酮等抗氧化物质和抗氧化酶，这类物质通常具有较好的抗氧化活性，能够有效清除体内自由基[4-6]。蒲公英的药用价值也与其所含黄酮类物质有较为直接的关系[7]。

本文通过单因素实验及正交实验对蒲公英黄酮类物质进行提取及工艺优化，以总黄酮含量为指标筛选其最佳提取工艺，并进一步对黄酮提取物的抗氧化活性进行评价，为蒲公英在食品、药品、化妆品等多种领域的进一步深加工提供理论支持。

1 实验部分

1.1 材料、试剂及仪器

蒲公英饮片购自人民同泰药店；无水乙醇（AR天津富宇）；DPPH（纯度95% 北京中生瑞泰）；芦丁（纯度95% 上海士峰）；NaNO2（AR 天津鸿鑫）；Al（NO3）3、NaOH，均为分析纯，天津科密欧。

DB-20 型紫外分光光度计（驭锘实业）；FW-100型高速万能粉碎机（北京光明）；DK-8D 型电热恒温水浴锅（上海一恒）；RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城）。

1.2 蒲公英总黄酮的提取工艺优化

1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取芦丁0.0200g，用无水乙醇定容至100mL 的容量瓶中[8]。分别吸取不同体积芦丁标准溶液置于25mL 比色管中，用体积分数为30%的乙醇补充至10mL，加入0.7mL 5%的NaNO2，混匀静置5min，加入0.7mL 10%的Al（NO3）3，混匀静置6min 后，再加入5mL 1mol·L-1NaOH 溶液，用30%的乙醇定容，静置10min 后，于510nm 波长测定吸光度[7]。

1.2.2 单因素实验 蒲公英药材粉碎后过80 目筛，分别选取不同料液比、提取次数、不同乙醇浓度、提取温度、提取时间对蒲公英总黄酮进行提取，并对提取液进行总黄酮含量的测定。

1.2.3 正交实验 根据单因素实验结果，选取提取温度（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）作为考察因素，每个因素设定3 个水平，以总黄酮含量为考察指标，采用L9（34）表进行正交实验[10,11]。

1.3 抗氧化活性实验

1.3.1 DPPH 自由基清除实验 用无水乙醇配制浓度为0.04%的DPPH 贮存溶液（40mg·mL-1），避光保存，备用。使用时将DPPH 贮存液进行10 倍稀释，得到浓度为0.004%的DPPH（4mg·mL-1）溶液。

分别取不同浓度的各样品溶液（2、1、0.5、1.25、0.625mg·mL-1）100μL，加入1.4 mL 无水乙醇，1.0mL的DPPH 溶液，室温避光或黑暗条件反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm 波长测定吸光值；以1.5mL 无水乙醇加1 mL DPPH 为对照。按下列公式计算DPPH 自由基清除率。用无水乙醇做空白对照。

式中 Ac：1.5mL 无水乙醇+1mL DPPH 的吸光度值；Ao：100μL 样品+1.4mL 无水乙醇+1mL DPPH 的吸光度值。

1.3.2 羟基自由基清除实验 蒲公英待测样品的制备：在试管中依次加入不同浓度的蒲公英黄酮提取液1mL、9mmol·L-1的FeSO4溶液1mL、9mmol·L-1的水杨酸乙醇溶液1mL、8.8mmol·L-1的H2O2溶液1mL。充分混匀，37℃孵育30min。在3000r·min-1下离心10min，取上清液，以水为参比液于510nm 处测吸光度Ax；在试管中加入待测液，其余试剂用蒸馏水代替，测得本底吸光度Ax0；生育酚（Trolox）作为阳性对照，阴性对照以蒸馏水代替，测得阴性对照吸光度A0。按下式计算羟自由基清除率：

式中 Ax：加入待测液后的吸光度值；Ax0：待测液本底吸光度值；A0：空白对照液吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

以芦丁为对照品进行总黄酮标准曲线的绘制。以吸光度Y 为纵坐标、浓度X 为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，见图1。

图1 芦丁对照品的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin control

通过单因素实验结果表明，乙醇浓度、提取温度和提取时间对蒲公英提取物总黄酮含量的影响较大，结果见图2~4。

图2 不同乙醇浓度对蒲公英提取物总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of different ethanol concentration on total flavonoids content of dandelion extract

图3 不同提取温度对蒲公英提取物总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of different extraction temperature on total flavonoids content of dandelion extract

由图2~4 可见，在乙醇浓度为50%时，蒲公英总黄酮含量最高，为0.7860mg·mL-1。在提取温度为70℃时，蒲公英总黄酮的含量最高，为0.7001mg·mL-1。在提取时间为70min 时，蒲公英总黄酮含量最高，为0.7762mg·mL-1。

为综合考察不同因素之间的交互影响，在单因素实验基础上进一步进行了正交优化实验分析。

2.2 正交实验结果

选择提取温度、乙醇浓度和提取时间为主要因素，进行正交实验，并对结果进行了直观分析和方差分析。结果见表1、2。

表1 蒲公英总黄酮提取的正交实验结果Tab.1 Orthogonal experiment results of total flavonoids extraction from dandelion

表2 正交实验方差分析表Tab.2 Variance analysis table of orthogonal test

由表1、2 可见，各因素对提取效果均有影响，影响大小顺序为乙醇浓度＞提取温度＞提取时间，实验结果表明，总黄酮的最佳提取工艺为A2B1C3，即在提取温度为70℃、乙醇浓度为40%、提取时间为80min时，总黄酮含量为0.9170mg·mL-1。

2.3 抗氧化活性评价

2.3.1 DPPH 自由基清除实验 蒲公英黄酮提取物的DPPH 自由基清除实验结果见图4。

图4 蒲公英提取物的DPPH 自由基清除实验Fig.4 DPPH scavenging of free radical from dandelion extract

图4 不同提取时间对蒲公英提取物总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of different extraction time on total flavonoids content of dandelion extract

由图4 可见，当蒲公英提取物浓度为4mg·mL-1时，DPPH 自由基清除率达到80.8%，IC50值为0.8492mg·mL-1。蒲公英提取物具有较好的清除自由基能力，且随着浓度的增大，清除率逐渐增强。阳性对照维生素C 的DPPH 清除自由基实验其IC50值为9.5μg·mL-1。

2.3.2 羟基自由基清除实验 羟基自由基清除实验结果见图5。

图5 蒲公英提取物的羟基自由基清除率实验Fig.5 Hydroxyl radical scavenging experiment of dandelion extract

由图5 可见，蒲公英提取物具有较好的清除羟基自由基能力，其IC50值为1.0717mg·mL-1，表明当蒲公英提取物浓度为1.0717mg·mL-1时，能够清除约50%羟基自由基。且随着蒲公英提取物浓度的增加，羟基自由基的清除率也随之增加，二者总体呈正相关。阳性对照生育酚（Trolox）的羟基自由基清除能力IC50值为0.022mg·mL-1。

虽然蒲公英提取物清除DPPH 自由基与羟基自由基的能力与阳性对照比还有一定的差距，但作为一种分布广泛、易获得的道地药材，其应用和开发潜力仍然值得人们关注。

3 结论

本文通过单因素实验和正交实验优化提取蒲公英中总黄酮，最佳提取工艺为：乙醇浓度为40%，提取温度为70℃，提取时间为80min。此时，总黄酮含量为0.9170mg·mL-1。进一步对蒲公英黄酮提取物进行DPPH 自由基清除实验和羟基自由基清除实验，结果表明，蒲公英黄酮提取物具有良好的抗氧化及清除自由基能力。