miR17-92簇在痛风中的表达及临床意义

冯丹 姜蓉琼 杨桂钊 张惠 王丹 刘静 余成秀 袁国华

（1.川北医学院附属医院风湿免疫研究所，南充 637000； 2.川北医学院附属医院呼吸内科，南充 637000）

痛风是尿酸盐晶体沉积于皮下、关节、滑膜或肾脏等组织及器官引起的一组异质性代谢性慢性疾病［1］。与嘌呤代谢障碍和/或尿酸排泄减少引起的高尿酸血症直接相关，血清尿酸与痛风存在显著浓度依赖性［2］。临床上痛风有4个发展阶段：无症状高尿酸血症、急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AG）、间歇期痛风（intermittent gout，IG）和慢性痛风石性痛风，这4个发展阶段并非依序而来。急性期患者常伴有高尿酸血症，且并非所有患者出现高尿酸血症就会进展为痛风性关节炎（gouty arthritis,GA），高尿酸血症向痛风进展的机制仍不完全清楚［1］。IG患者长期未控制的高尿酸血症可能造成不良预后，伴随多种并发症，包括心血管疾病、慢性肾病、肥胖等，甚至出现关节尿酸盐沉积导致残疾丧失生活能力，对个人及社会均造成极大负担［3］。因此本研究着眼于阐明IG患者合并高尿酸血症的原因及机制。

miRNA是由约22个核苷酸组成的短链非编码RNA分子，通过靶向mRNA的3'UTR位点介导基因沉默，抑制蛋白翻译或促进mRNA降解［4］。根据某些miRNA种子序列相似性，可将相似的成簇排列的miRNAs分为miRNA簇（miRNA cluster）［4］。其中miR17-92簇宿主基因（MIR17HG）跨越7 kb，包含800个核苷酸的miR-17-92簇转录物可编码6种miRNAs：miR17、miR18a、miR19a、miR20a、miR19b-1和miR92a-1，即miR17-92簇［5］。miRNA簇失调导致生物学功能改变是许多疾病的关键发病机制，可潜在调节细胞功能，包括生长、增殖、分化、发育、代谢、感染、免疫、细胞死亡、细胞器生物发生、信号转导、DNA修复和自我更新等［6-7］。近期多项研究提示miR-17-92簇各成员可能与痛风发病相关［7］。同时结合临床工作，Janus酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路引起广泛关注，JAK-STAT通路是主要的细胞内信号转导通路之一，是各种细胞因子、激素和生长因子的重要下游介质［8］。研究发现IFN-γ是JAK-STAT通路免疫应答和信号的重要调节因子［9］；IL-10主要由单核细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞分泌，是一种调节细胞生长和分化的多功能细胞因子，参与炎症和免疫应答，被认为是炎症和免疫的抑制因子，参与急性痛风自发缓解［10-11］。本研究拟探索miR17-92簇及JAK-STAT通路成员在GA患者中的表达，测定IFN-γ及IL-10表达，寻找miR17-92簇可能的信号通路及作用机制，更好了解GA的发病机制，为寻找新的治疗靶点提供方向。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 根据1977年美国风湿病协会（ACR）诊断标准或2015年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟痛风分类标准确定本实验研究对象［12］。收集2020年底至2021年底于川北医学院附属医院风湿免疫科确诊的痛风患者67例。其中AG患者22例，年龄16～72岁，平均年龄（45.6±14.6）岁，IG患者45例，年龄15～81岁，平均年龄（40.0±14.4）岁。研究对象均为男性，排除尿酸盐肾病、尿酸盐性尿路结石及肝肾功能损害患者，同时排除患有感染、乙肝、结核、肿瘤及药物等继发因素所致尿酸升高及合并其他疾病者。收集患者临床及实验室资料。对照组选择性别、年龄相符及血尿酸正常（UA＜360 μmol/L）的健康男性体检者（HC）35例，年龄27～77岁，平均年龄（42.3±11.5）岁，均排除有痛风家族史、感染、肿瘤及可疑导致尿酸升高用药史等疾病史者。两组研究对象年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经川北医学院附属医院伦理委员会批准，受试者知情同意。

1.1.2 主要试剂及仪器 miR17-92簇检测采用茎环法，设计茎环引物，内参使用U6，miRNA引物由上海元莘生物工程有限公司设计合成，其余引物由上海生工生物工程有限公司合成。全血总RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（上海元莘生物工程有限公司）；荧光定量PCR系统（美国Life Technologies公司）；HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。引物序列见附表1、附表2（www.immune99.com）。

表1 痛风相关基因及相互作用的miR17-92簇Tab.1 Gout-related genes and interacting with miR17-92 cluster

表2 miR17-92簇与JAK-STAT通路的靶向作用关系Tab.2 Relationship between miR17-92 cluster and JAKSTAT pathway

1.2 方法

1.2.1 生物信息学研究 通过miRWalk等数据库预测miR17-92簇可能的靶基因。搜索目前已研究的痛风相关致病基因及miRNA，搜索可能作用于JAK-STAT通路的miRNA，使用GSEA基因富集功能研究其交集并绘制相关图谱。

1.2.2 miRNA茎环法逆转录及RT-PCR 使用Trizol提取RNA，根据试剂盒说明将体系中的Oligo（dT）18和Random hexamers更换为miRNA特异性茎环引物和反向引物进行逆转录。产物cDNA根据试剂盒进行PCR反应，以U6为内参进行计算，基因表达倍数差异以RQ=2-ΔΔCt表示。

1.2.3 普通逆转录及RT-PCR 使用Trizol提取RNA，根据说明进行逆转录。所得产物cDNA根据试剂盒及反应条件进行PCR反应，基因表达倍数差异以RQ=2-ΔΔCt表示。

1.2.4 各项实验室指标收集 检测下列指标：碱性磷酸酶（ALP）、腺苷脱氨酶（ADA）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、尿酸（UA）、肌酐（Crea）、葡萄糖（Glu）、血沉（ESR）、超敏C反应蛋白（hsCRP）、白细胞（WBC）、中性粒细胞（NE）、单核细胞（MO）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）。

1.3 统计学处理 数据采用IBS SPSS26数据包及GraphPad prism 8软件处理，计量资料且符合正态分布的以表示，不符合正态分布的以M（Q1，Q3）表示。多组间两两比较采用Kruskal-WallisH检验，变量间相关性分析采用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析 通过以关键词GOUT搜索数据库miRwalk中已明确的靶基因及其相关作用的miRNAs，通过GSEA基因富集共得到8个靶基因HP、A1CF、SLC17A3、ADRB3、IL33、ABCG2、PRPS1、LPA作用于GA，1 553个miRNAs作用于痛风，包括miR17-92簇中的miR17-5p、miR18a-5p、miR20a-5p（表1）。进一步挖掘miR17、miR18a、miR19a相关靶基因，其中miR17通过基因富集作用得到2 326个靶基因；miR18a通过基因富集作用得到2 252个靶基因；miR19a通过基因富集作用得到268个靶基因。miR17-92簇所有成员与JAK-STAT通路中的相互靶向作用见表2，miRNA调控靶基因机制复杂，即使调控同一基因可能靶向不同疾病及不同效应，具体机制需进一步研究。将miR17、miR18a、miR19a及GA可能靶基因的相关靶基因绘制韦恩图（图1）。GA与JAK-STAT通路相关miRNA见图1，其交集中共同作用的miRNAs中包含miR17-92簇中的miR17、miR18a和miR20a，初步估计miR17-92簇可通过JAK-STAT通路参与痛风发病机制。搜索过程中发现其他信号通路也较大程度参与痛风病理过程，但痛风急性发作及缓解机制仍不明确，进一步研究痛风致病机制尤为重要。

图1 靶向作用于GA与JAK-STAT通路的miRNAsFig.1 miRNAs associated with GA and JAK-STAT pathway

2.2 miR17-92簇中各成员表达分析 miR17、miR18a、miR19a、miR20a、miR19b在AG、IG、HC中表达差异均有统计学意义（H=8.753，P＜0.05；H=6.338，P＜0.05；H=6.523，P＜0.05；H=9.061，P＜0.05；H=9.729，P＜0.01），miR92a在3组间表达差异无统计学意义。其中AG、IG组miR17a表达4.350 5（0.673 6，7.148 7）、2.482 3（0.743 6，5.104 1）明显高于HC对照组0.920 2（0.478 8，2.505 1），差异均有统计学意义（P＜0.05，图2A）。IG组miR18a表达2.127 4（1.325 0，5.055 0）高于HC对照组1.304 7（0.580 7，2.860 7），差异有统计学意义（P＜0.05，图2B）。AG组miR19a表达4.039 7（0.671 7，7.955 0）高于HC对照组0.941 6（0.489 0，1.998 1），差异均有统计学意义（P＜0.05，图2C）。AG组miR20a表达7.048 8（0.862 3，17.294 4）明显高于HC组1.010 5（0.248 6，3.973 6），差异有统计学意义（P＜0.01，图2D）。AG组miR19b表达4.371 4（0.449 0，9.752 1）明显高于HC组0.988 0（0.426 1，2.271 3），差异有统计学意义（P＜0.01，图2E）。

图2 AG、IG及HC组miR17-92簇各成员相对表达Fig.2 Relative expressions of miR17-92 cluster in AG，IG and HC groups

2.3 JAK-STAT信号通路中各成员mRNA表达JAK3、STAT2在AG、IG、HC三组中表达差异有统计学意义（H=10.349，P＜0.01；H=14.801，P＜0.01，图3）。其中IG、HC组JAK3表达1.119 1（0.753 9，1.602 7）、1.024 5（0.529 5，1.948 4）高于AG组0.526 0（0.326 7，1.206 3），差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。AG、HC组STAT2表达1.377 5（0.674 2，2.486 9）、1.233 6（0.755 8，1.511 6）明显高于IG组0.701 5（0.296 8，1.238 1），差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。各组间JAK1、JAK2、STAT1、STAT3未见明显差异。

2.4 IFN-γ及IL-10相对表达 IFN-γ三组间表达差异有统计学意义（H=8.734，P＜0.05）。其中HC组IFN-γ mRNA表达0.754 1（0.677 1，1.752 7）高于AG、IG患者相对表达0.483 6（0.169 6，0.794 1）、0.472 7（0.249 2，0.938 2），差异有统计学意义（P均＜0.05，图4A）。而3组间IL-10 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05，图4B）。

图4 AG、IG及HC组IFN-γ及IL-10相对表达Fig.4 Relative expressions of IFN-γ and IL-10 in AG， IG and HC groups

2.5 AG、IG组miR17-92表达与临床资料相关性分析

2.5.1 AG组miR17-92表达与临床资料相关性分析 AG患者miR18a表达与IBIL、Crea、MO、HGB呈负相关（rs=-0.79，P＜0.01；rs=-0.55，P＜0.05；rs=-0.63，P＜0.05；rs=-0.68，P＜0.01）。miR19a表达与TC、UA、HGB呈负相关（rs=-0.90，rs=-0.45，rs=-0.45，P均＜0.05）。miR20a表达与Crea呈负相关（rs=-0.45，P＜0.05）。miR19b表达与UA、HGB呈负相关（rs=-0.51，rs=-0.45，P均＜0.05，表3）。

表3 AG患者miR17-92簇表达与临床资料相关性分析Tab.3 Correlation analysis between miR17-92 cluster expressions and clinical data in AG patients

2.5.2 IG组miR17-92表达与临床资料相关性分析 IG患者miR17表达与IBIL、WBC、LY、MO均呈负相关（rs=-0.55，rs=-0.49，P均＜0.05；rs=-0.61，rs=-0.70，P均＜0.01），miR18a表达与ALP呈正相关（rs=0.52，P＜0.05）。miR19a表达与TC、UA呈负相关（rs=-0.55，rs=-0.40，P均＜0.05）。miR20a表达与ADA、UA呈负相关（rs=-0.41，P＜0.05；rs=-0.64，P＜0.01，表4）。

表4 IG患者miR17-92簇表达与临床资料相关性分析Tab.4 Correlation analysis between miR17-92 cluster expressions and clinical data in IG patients

3 讨论

现阶段痛风发作及缓解机制尚不明确，主要观点为单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）晶体与巨噬细胞相互作用触发炎症，诱导中性粒细胞和单核细胞浸润，扩大炎症反应。同时随着TGF-β1等多种机制参与，巨噬细胞吞噬作用等可诱导炎症自发缓解［13-14］。近年多项研究提示miRNAs积极参与痛风致病过程调控。

本研究通过明确miR17-92簇在GA患者中的表达，发现AG患者miR17、miR19a、miR20a、miR19b表达均较健康对照组升高，而IG患者仅有miR17、miR18a升高。提示miR17-92簇对痛风急性发作及自发缓解后间歇期均发挥调控作用，而miR18a等在AG与IG中差异表达，提示其时效特异性可能参与急性痛风自我缓解机制。BOHATÁ等［15］在间歇期痛风患者中测得miR17、miR18a表达升高，且发现AG中miR17水平仍显著升高，而miR18a表达差异无统计学意义。

miRNA通过抑制mRNA降解或蛋白表达介导靶基因沉默。本研究也通过生物信息学分析发现miR17-92簇成员不同程度通过JAK-STAT通路参与多种病理生理调节，因此进一步预测并检测miR17-92簇可能的作用靶基因JAK-STAT家族。其中JAK3相对表达在AG患者中较IG、HC明显降低，提示JAK3作用于急性痛风发作。STAT2在IG中降低，AG患者STAT2表达高于IG，但与HC无明显差异，提示JAK-STAT参与痛风发生发展过程。结合前述生物学信息学分析miR17、miR18a、miR20a、miR19b可共同靶向JAK3，miR17、miR18a、miR20a可共同靶向STAT2，推测miR17-92簇可能通过靶向调控JAK-STAT信号通路参与痛风病理过程。AG、IG患者IFN-γ相对表达均下调，而IFN-γ是JAKSTAT通路免疫应答和信号的重要调节因子，STAT1及STAT2可被IFN-γ直接激活诱导表达［9，16-17］。提示miR17-92簇可能通过下调IFN-γ表达负向调控JAK-STAT通路。

多项研究表明miR17-92簇成员如miR17、miR18a、miR20a、miR19a和miR92a等通过调控JAK1/STAT3、JAK2/STAT3轴等参与多种风湿免疫性疾病致病过程［18-20］。另一项研究提示miR19a和miR19b可靶向TLR2 mRNA，并降低类风湿关节炎中成纤维细胞样滑膜细胞TLR2蛋白表达［21］。而TLRs是先天免疫系统中重要的模式识别受体，广泛参与病原体相关分子模式识别和感知，MSU可通过识别TLR2释放一氧化氮，导致后续系列炎症［22］。本研究中miR19a/miR19b在AG患者中相对表达均有所升高，提示miR19a/miR19b可能参与阻碍MSU对TLR2的识别而抗炎，从而在AG患者中发挥作用，其作用机制仍需进一步明确。

临床资料相关性分析中，AG患者miR18a表达与IBIL、Crea、MO、HGB呈负相关；miR19a表达与TC、UA、HGB呈负相关；miR20a表达与Crea呈负相关；miR19b表达与UA、HGB呈负相关。IG患者miR17表达与IBIL、WBC、LY、MO均呈负相关，miR18a表达与ALP呈正相关。miR19a表达与TC、UA呈负相关。miR20a表达与ADA、UA呈负相关。提示miR17-92簇可能参与调控痛风多项生理病理机制。

综上，痛风是一种常见的晶体性关节炎，但其发病机制尚不明确。为进一步明确其致病机制，本研究检测miR17-92簇在痛风患者中的表达，其差异表达提示可能参与痛风发病机制。其次通过预测miR17-92簇可能的靶基因JAK-STAT家族验证得出其可能参与痛风发病。本课题组后续将扩大样本量以及进行体内外研究明确miR17-92簇在痛风中的调控机制，为阐明痛风发病机制提供新视角。