光生物调节疗法治疗放射性口腔黏膜炎作用机制研究进展

陈敬儒,李凤丹,江银华

光生物调节疗法(photobiomodulation therapy,PBMT)是利用内源性生色团吸收光(包括可见光、红外线、近红外线)产生光化学或光物理反应,触发非热、非细胞毒性生物反应,可用于刺激组织再生、减少炎症和控制疼痛的光疗法[1]。放射性口腔黏膜炎(radiation-induced oral mucositis,RTOM)是头颈部恶性肿瘤患者接受放射治疗后常见并发症之一,其主要表现为黏膜干燥,灼痛,溃疡,当损伤波及黏膜下层时造成剧烈疼痛影响患者进食,严重者中断放疗[2],发病率为80%～100%[3]。根据RTOM临床表现特点,临床实践多采取对症治疗(口腔护理,抗菌镇痛药物,冷冻疗法等方式),以促进创口愈合,缓解患者痛苦,降低其对患者放疗病程的影响[4]。虽然PBMT治疗作用的生物机制尚未完全阐明,但其控制疼痛,促进组织愈合的临床作用,已得到临床研究证实[5-7]。本文就PBMT在RTOM治疗中作用机制研究进展进行综述。

1 PBMT

PBMT起源可追溯至20世纪60年代,Mester教授发现剃毛小鼠接受低水平红宝石激光照射后,毛发增长加速[8]。随后他又发现氦氖激光照射能促进小鼠创口愈合[9],并将研究结论逐步应用于临床溃疡治疗。在PBMT研究早期,以激光为主要研究对象,该疗法后续也被称为低水平激光疗法(low-level laser therapy,LLLT),因其与用于消融、切割和凝固的其他医疗激光治疗形式相比,这种光的强度较低,组织细胞在电子水平上吸收激光,并不产生热量[10]。20世纪90年代,研究人员将发光二极管(light emitting diode,LED)技术引入临床研究实践[11],发现LED照射组织,同样被吸收的光子不会以热量的形式损失,而是直接转移到吸收细胞或发色团,引起靶细胞的光激活和它们相关活性的某种变化[12]。LLLT和LED也成为现在临床应用较多的PBMT治疗模式。

对PBMT机制研究,发现线粒体呼吸链中细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,CCO)和光/热门控离子通道为主要的内源性生光团。CCO吸收摄入光子发生光化学级联反应以及质膜光敏离子通道的激活,增加电子传递链中三磷酸腺苷和活性氧的形成,以此激活多种转录因子和信号通路[13]。

随着技术的进步,PBMT设备种类繁多,如氩气(Ar),氦氖(He:Ne),二氧化碳(CO2)激光,钕-铝-石榴石(Nd:YAG),铒钇石榴石(Er:YAG)和铝砷化镓(GaAlAs)二极管等,并且更多的广谱光源如碳光子也用于临床治疗。

2 RTOM发病机制

RTOM作为头颈部肿瘤患者接受放疗后常见的并发症,其发病机制的研究受广泛关注。Sonis研究建立RTOM五期模型[14](起始-初始损伤-信号放大-溃疡-愈合),表明电离辐射诱导DNA断裂致使细胞凋亡,死亡细胞释放内源性损伤相关模式分子(damage associated molecular patterns,DAMPs),引起免疫应答。同期活性氧(reactive oxygen species,ROS)分泌增加介导非DNA损伤,激活NF-κB信号通路,NF-κB上调环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),COX-2作为通过在前列腺素产生中发挥作用而参与炎症的诱导酶,参与电离辐射暴露后组织的无菌性炎症[15]。继而释放促炎症因子。成纤维细胞受到电离辐射损伤,致使基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的分泌,如MMP1和MMP3,分别降解胶原上皮下基质和分解上皮基底膜[16],口腔黏膜完整性被破坏,细菌定植继发感染加重RTOM。随着对RTOM病理机制研究的深入,Paris等[17]应用C57BL/6小鼠全身照射模型(12～15 Gy)研究,发现辐射造成微血管内皮损伤是导致黏膜损伤阻碍干细胞增殖分化的原发病变,同时进一步验证基底膜结合的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)保护内皮细胞免受辐射诱导的细胞死亡,而微血管基底膜因缺乏bFGF沉积致使辐射敏感性增加。

3 PBMT治疗RTOM的作用机制

3.1 减轻炎症反应

RTOM发生发展过程的关键在于ROS产生及促炎症因子释放导致黏膜细胞凋亡,形成炎症反应正反馈扩大损伤。对此,PBMT通过参与调节巨噬细胞极化和炎症细胞因子表达[18],达到抑制炎症反应,减缓促炎症因子释放的目的。当巨噬细胞受到损伤、感染等刺激后会迅速激活成具有不同生理特性的不同表型,M1表型巨噬细胞表达并分泌炎症分子,如细胞因子白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及趋化因子CCL3、CCL4和CXCL2,导致炎症急性期;M2表型巨噬细胞表达并分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子(transforming growth-factor,TGF)和胰岛素生长因子(insulin growth factor,IGF)促进后期肉芽组织的形成[19]。研究发现660 nm红激光照射4 h后M1表型巨噬细胞下调CCL3、CXCL2、TNF-α和M2表型巨噬细胞CXCL2mRNA表达,780 nm红激光照射4 h后M2表型巨噬细胞抗炎因子TGF-β1表达上调,以降低急性炎症损伤的严重程度[20]。此外,有研究发现PBMT能抑制极化后的巨噬细胞分泌ROS,并上调Nrf2的表达。Nrf2作为氧化还原敏感的转录因子,可调节氧化应激反应,并通过调节细胞因子的产生和与NF-κB信号通路产生交叉作用抑制炎症,在炎症刺激或氧化应激引起的疾病中发挥保护作用[21]。Silveira等[22]研究PBMT对大鼠急性肌肉损伤炎症过氧反应的影响,发现早期应用PBMT有效地恢复超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,抗氧化酶)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)在组织内水平,抑制损伤肌肉中氧化应激状态的诱导。将PBMT用于临床研究进一步验证其抗炎效果发现,对55例老年RTOM患者进行分组,PBMT组患者与安慰剂组患者(20.7%)相比抗炎药物处方使用率明显下降(34.6%)[23]。

3.2 促进细胞增殖

口腔黏膜细胞属于快反应细胞,其损伤修复关键在于角质形成细胞、成纤维细胞和间充质干细胞快速增殖分化以对抗电离辐射诱导的细胞凋亡[24]。对此,PBMT可通过诱导损伤处角质形成细胞、成纤维细胞和胶原蛋白增殖分化以促进创口修复[25]。PMBT最重要的发色团之一是细胞色素C氧化酶(线粒体呼吸链中的第4单元),通过吸收红光取代一氧化氮(NO)激活铜和血红素中心,在线粒体内产生质子梯度,从而释放大量的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP),能量的增加促进细胞增殖移动[26]。PBMT作用后从CCO解离的NO是一种有效的血管扩张剂,增加微循环中血液和氧气供应,改善辐射所致的微循环损伤[27]。此外,PBMT激活线粒体表面光敏离子通道,使得钙离子进入,促进环磷酸腺苷(cAMP)和ROS释放。高浓度的R0S具有细胞毒性,导致多个信号级联被中断[28],而适量ROS可在ATP合成的生产过程中产生正常代谢,并调节氧化还原反应和参与增殖、分化的蛋白质[29],PBMT诱导正常细胞系中ROS产生适度地增加,同时其能降低已经暴露于氧化应激反应的细胞中的ROS水平[30]。研究表明[31],PBMT也可促进组织释放碱性成纤维细胞生长因子,角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)等生长因子释放,促进肉芽组织的生成,上皮细胞的增殖迁移,诱导上皮再形成以及维持上皮的正常结构。

Bourouni等使用810 nm二极管激光体外培养人成骨样细胞MG36(human osteoblast-like cell MG36)和人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF),发现人成骨样细胞MG36和HGF在24、48、72 h照射点其增殖率均明显增加,且编码Ⅰ型胶原纤维的前α1链基因(COL1α1)表达增强[32]。Li等[33]研究发现使用1.0、2.0、4.0 J/cm2,650 nm半导体铝砷化镓激光器照射人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),通过促进磷脂酰肌醇-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)的磷酸化,激活PI3K/Akt途径,使其出现剂量依赖性增殖,并且划痕实验表明PBMT对HUVEC移动速度具有诱导性(6.36、8.98和11.68 μm/h)。Gang团队将CO2激光应用于RTOM小鼠模型,同样发现CO2激光诱导创面上皮细胞增殖,加速创口再上皮化,上调热休克蛋白-70和黏连蛋白C的表达[34]。

3.3 抑制创面细菌生长

RTOM发展至溃疡阶段常合并口腔内微生物感染加重。因放疗导致患者口腔黏蛋白随唾液分泌减少而减少,口腔黏蛋白无法充分与微生物结合形成悬浮微生物聚集,阻止微生物附着于黏膜上皮[35-36],致使病原菌在口腔内大量增殖,通过病原相关分子模式渗入体内,其鞭毛蛋白与宿主Toll样受体5(TLR5)结合,通过募集NF-κB和产生促炎细胞因子,启动典型的促炎途径[37]。研究表明,特定发色团靶标复合物Ⅳ是真核生物线粒体呼吸链的细胞色素C氧化酶,在细菌中也作为大型跨膜蛋白复合物存在[38]。当治疗剂量激光照射至黏膜损伤部位时,该区域的细菌会同时吸收能量,激活细胞膜钙离子通道和短暂的ROS爆发,影响细菌增殖[39]。Robati等采用980 nm二极管激光以5、10和20 J/cm2的能量照射体外培养变形链球菌、嗜酸乳杆菌,在暴露即刻和24 h后,菌落数目均有明显下降[40]。Nussbaum等的研究发现,810 nm低功率激光以5、10、20和50 J/cm2的剂量照射抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长,且呈剂量依赖性[41]。口内菌群以生物膜形式附着于牙体和黏膜,形成宿主免疫防御机制。Basso等[42]将变形链球菌(Streptococcusmutans,SSB)、白念珠菌(Candidaalbicans,DSB)以及2者混合进行体外培养,使用780 nm铝砷化镓二极管激光器以5、10、20 J/cm2按250 s、500 s和1 000 s时间点进行照射,发现激光照射抑制单独培养的SSB中琥珀酸脱氢酶活性和SSB、DSB各自生物膜形成,但在混合培养生物膜中,SSB因DSB存在而对PBMT产生一定的耐药性。扫描电镜下观察微生物的形态未发生改变,但SSB对玻璃基质的黏附作用减弱,生物膜中微生物结构存在一定的分解。虽然RTOM发病机制存在ROS诱导组织损伤过程,但PBMT同时可上调机体内SOD对抗氧化应激。临床试验表明,PBMT在防治RTOM的过程中,并不会对周围组织产生损害[43]。

3.4 缓解疼痛

RTOM产生疼痛主要包括伤害性疼痛和神经性疼痛[44]。辐射导致组织损伤释放炎性介质激活痛觉感受器的瞬时受体电位家族离子通道(transient receptor potential,TRP)从而产生疼痛[45]。ROS作为瞬时感受器重要的内源性激动剂,提高外周和中枢神经敏感性,从而引发神经性疼痛[46]。辐射损伤造成持续性疼痛会导致神经元活动特异性持续,改变突触的结构和功能,周围神经功能障碍疼痛加剧,产生额外的神经性疼痛[47]。PBMT作为一种非药物治疗手段,通过抑制ROS和促炎症因子释放、促进组织细胞快速修复、促进内源性阿片类物质释放来缓解疼痛[48]。研究人员用830 nm铝砷化镓二极管激光照射大鼠足底炎症模型,发现PBMT通过促进含有阿片类物质的免疫细胞优先迁移到炎症部位,释放内啡肽,激活疼痛抑制阿片类受体[49],内源性阿片类物质可通过分泌前体分子促肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素释放因子引起外周镇痛[50]。但该反应存在照射剂量限制,研究推荐采用3 J/cm2或8 J/cm2激光强度以获得良好的镇痛效果。此外,研究发现采用PBMT能可逆性破坏背根节神经元中微管结构,抑制快轴突电流和线粒体膜电位,抑制神经传导所需能量合成,使得痛觉传导抑制[51]。姜彤等[52]将60例口腔癌放疗患者分为2组,应用632.8 nm氦氖激光以缓解RTOM患者疼痛[52],发现PBMT治疗组患者疼痛程度以及疼痛持续时间(5.31±6.43)d和对照组疼痛程度和疼痛持续时间(9.89±6.08)d相比,显著降低(P<0.05)。此外,PBMT组和对照组患者使用阿片类镇痛药的使用率分别为7%和21%(P<0.001)。

4 PBMT治疗参数及疗效

目前PBMT治疗RTOM最佳参数指标在探索中,但研究人员在世界激光治疗协会会议(WALT)上总结建议使用红色或近红外光LED/激光设备[53],①口内设备预防RTOM:放疗前30～120 min,每个治疗场的总剂量为1.2爱因斯坦(650 nm的光子通量=5.7 pJ/cm2),波长630～680 nm,功率密度10～50 mW/cm2。②口内设备治疗RTOM:波长630～680 nm,功率密度10～50 mW/cm2。总剂量为2.5爱因斯坦(光子通量在650 nm=11.4 pJ/cm2),3～4次/周,共15～20次,或直至放疗结束RTOM创口愈合。③设备经皮肤预防RTOM:放疗前30～120 min,每个治疗场的总剂量为1爱因斯坦(810 nm的光子通量=4.5 pJ/cm2),波长800～1 100 nm,功率密度30～150 mW/cm2。④设备经皮肤治疗RTOM:每个治疗场的总剂量为2爱因斯坦(光子通量在810 nm=9 pJ/cm2),波长800～1 100 nm,功率密度30～150 mW/cm2。3～4次/周,共15～20次,或直至放疗结束RTOM创口愈合。其余400～1 100 nm可适当调整剂量使用,但所有操作过程要实时监控温度<45 ℃。此外,在近期的科研实践中,对PBMT疗效也进行了一定的总结分析。一项纳入8项实验的系统性回顾性研究表示[54],7项实验(792例患者)一致表明≥3级RTOM发生率、持续时间和强度降低,肠外营养和阿片类药物使用减少。另一项系统性回顾研究也表明[55],PBMT对RTOM具有良好的治疗效果,显著降低重度RTOM持续时间、发病率和疼痛度。对其安全性分析,Antunes等[56]对94例头颈部肿瘤放化疗患者随机分组,进行时长41.3个月的跟踪随访,发现经过PBMT治疗的患者总生存率为57.4%,对照组患者生存率为40.4%;并且在肿瘤治疗过程中,对照组患者出现胃肠道病变、中断放化疗和使用阿片类药物的频率更高。但目前缺乏接受PBMT治疗患者远期疗效的追踪观察,如治疗结束后并发症、肿瘤复发等情况。

5 小 结

PBMT作为一种安全、无痛的非药物治疗手段,因其有效的抗炎镇痛促愈合作用,在口腔临床医学领域被推荐使用。但PBMT与其他疗法联合的最佳组合、PBMT是否可长期应用等细节问题尚没有明确统一的答案。其次PBMT对RTOM作用机制研究主要在于其抑制炎症因子分泌、促进组织愈合和缓解疼痛。虽然多项研究表明PBMT对细菌生长存在抑制作用,但其作用机制,抑制靶点尚未完全明了,此外除了研究对体外培养单一菌群变化的作用外,PBMT对口内多种菌种混合形成生物膜的作用以及不同能量和波长对菌群是否存在抑制作用仍需进一步验证。